李卿明 張勝亮 徐庭華 宋金珂

(貴州省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科，貴陽 550001)

乳腺癌的發(fā)生受多種因素影響，其中原癌基因激活和抑癌基因失活在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。前列腺跨膜上皮抗原(prostate transmembrane epithelial antigen 1,STEAP1)最早被發(fā)現(xiàn)于前列腺癌，為前列腺特異性細(xì)胞表面抗原家族成員，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮癌基因作用[2，3]。STEAP1在乳腺癌組織中低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌基因作用，但作用機(jī)制尚未明確[4]。Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。本文研究過表達(dá)或沉默STEAP1對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移及Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討STEAP1對乳腺癌的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌BT549細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，載有STEAP1 cDNA轉(zhuǎn)染的慢病毒、載有STEAP1特異性RNA干擾的慢病毒及相應(yīng)陰性對照病毒(上海吉凱公司)，兔抗人STEAP1單克隆抗體、兔抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體、兔抗人MMP9單克隆抗體、兔抗人Wnt單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，TRIzol試劑、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(美國BPB公司)，CCK8試劑、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BT549細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%以上融合度時，胰酶消化并收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將轉(zhuǎn)染STEAP1 cDNA慢病毒的BT549細(xì)胞作為STEAP1過表達(dá)組(LV-STEAP1)，轉(zhuǎn)染STEAP1 RNA干擾慢病毒作為沉默STEAP1組(siR-STEAP1)，并設(shè)空白對照組(BC)及陰性對照組(NC)。將生長良好的BT549細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入96孔板(1×106個/孔)，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染前1 h更換不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合85%以上時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，LV-STEAP1組加入STEAP1 cDNA轉(zhuǎn)染的慢病毒，siR-STEAP1組轉(zhuǎn)染STEAP1 RNA干擾慢病毒，NC組加入陰性對照慢病毒，BC組不轉(zhuǎn)染病毒，培養(yǎng)48 h后Western blot和RT-PCR測定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3Western blot檢測BT549細(xì)胞STEAP1蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，每組設(shè)7個復(fù)孔，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，10 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白煮沸變性5 min，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入聚偏乙烯膜，加入脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶300)孵育過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參，ECL法發(fā)光，檢測各蛋白條帶灰度值，STEAP1蛋白水平以STEAP1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.4RT-PCR測定BT549細(xì)胞STEAP1 mRNA水平 取轉(zhuǎn)染48 h后的BT549細(xì)胞，加入TRIzol裂解5 min，提取總RNA，分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR測定STEAP1 mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s；95℃ 5 s，58℃ 30 s，共40個循環(huán)，以2-ΔΔCt表示。

1.2.5CCK8測定BT549細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后各組BT549細(xì)胞接種于96孔板(2×103個/孔)，每組設(shè)7個復(fù)孔，分別于1、3和5 d時加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)1 h，測定450 nm處吸光度。

1.2.6Transwell法測定BT549細(xì)胞侵襲能力 將Matrigal膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后均勻鋪于Transwell小室上室，孵育2 h，取轉(zhuǎn)染48 h的BT549細(xì)胞懸液加入鋪有Matrigal膠的上室，下室加入完全培養(yǎng)基孵育24 h，取上室液體，擦去上室細(xì)胞，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，樹膠封片，顯微鏡下觀察穿過底膜的細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7劃痕實(shí)驗(yàn)測定BT549細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染48 h的各組BT549細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)7個復(fù)孔，培養(yǎng)至90%融合度時用200 μl槍頭垂直劃線，顯微鏡下測量劃痕距離(0 h)，將劃痕后細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，顯微鏡下測量劃痕距離(24 h)，計(jì)算細(xì)胞遷移距離(遷移距離=0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)。

1.2.8Western blot檢測BT549細(xì)胞PCNA、Vimentin、MMP9、Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平 分別以兔抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體、兔抗人MMP9單克隆抗體、兔抗人Wnt單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體為一抗進(jìn)行測定，Western blot方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1過表達(dá)和沉默STEAP1對BT549細(xì)胞STEAP1表達(dá)的影響 與BC組和NC組相比，LV-STEAP1組細(xì)胞STEAP1蛋白和mRNA水平升高(P<0.05)，siR-STEAP1組細(xì)胞STEAP1蛋白和mRNA水平降低(P<0.05)，見表1、圖1和表2、圖2。

圖1 Western blot檢測過表達(dá)STEAP1對STEAP1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Western blot for effect of overexpressed of STEAP1 on STEAP1 protein levels

圖2 沉默STEAP1對STEAP1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of silence of STEAP1 on STEAP1 protein level

表1 過表達(dá)STEAP1對STEAP1蛋白和mRNA水平的影響Tab.1 Effect of overexpressed of STEAP1 on STEAP1 protein and mRNA

表2 沉默STEAP1對STEAP1蛋白和mRNA水平的影響Tab.2 Effect of silence of STEAP1 on STEAP1 protein and mRNA

2.2過表達(dá)和沉默STEAP1對BT549細(xì)胞增殖的影響 與BC組和NC組相比，1 d時各組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),3 d和5 d時LV-STEAP1組細(xì)胞中增殖率降低(P<0.05)，siR-STEAP1組細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)，見表3、4。

表3 過表達(dá)STEAP1對BT549細(xì)胞增殖的影響Tab.3 Effect of overexpressed STEAP1 on proliferation in BT549

表4 沉默STEAP1對BT549細(xì)胞增殖的影響Tab.4 Effect of silence STEAP1 on proliferation of BT549

2.3過表達(dá)和沉默STEAP1對BT549細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與BC組和NC組相比，LV-STEAP1組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，遷移距離縮短(P<0.05)，siR-STEAP1組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，遷移距離延長(P<0.05)，見表5、6和圖3～6。

表5 過表達(dá)STEAP1對BT549細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移距離的影響Tab.5 Effect of overespressed STEAP1 on number of inva-sive cells and migration distance of BT549

表6 沉默STEAP1對BT549細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移距離的影響Tab.6 Effect of silence STEAP1 on number of invasive cells and migration distance of BT549

圖3 Transwell測定過表達(dá)STEAP1對BT549細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)Fig.3 Transwell to determine effect of overexpresseol STEAP1 on invasive ability of BT549 cells (×400)

圖4 Transwell測定沉默STEAP1對BT549細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)Fig.4 Transwell to determine effect of silence STEAP1 on invasive ability of BT549 cells (×400)

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)測定過表達(dá)STEAP1對BT549細(xì)胞遷移能力的影響(×200)Fig.5 Scratch test to determine effect of overexpressed migration ability of BT549 cells (×200)

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)測定沉默STEAP1對BT549細(xì)胞遷移能力的影響(×200)Fig.6 Scratch test to determine effect of silence STEAP1 on migration ability of of BT549 cells (×200)

2.4過表達(dá)和沉默STEAP1對BT549細(xì)胞PCNA、Vimentin、MMP9蛋白水平的影響 與BC組和NC組相比，LV-STEAP1組細(xì)胞PCNA、Vimentin、MMP9蛋白水平降低(P<0.05)，siR-STEAP1組細(xì)胞PCNA、Vimentin、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)，見表7、圖7和表8、圖8。

圖7 Western blot檢測過表達(dá)STEAP1對PCNA、Vimentin、MMP9蛋白水平的影響Fig.7 Western blot for effect of overexpressed STEAP1 on PCNA，Vimentin and MMP9 protein levels

圖8 Western blot檢測沉默STEAP1對PCNA、Vimentin、MMP9蛋白水平的影響Fig.8 Western blot for effect of silence of STEAP1 on PCNA，Vimentin and MMP9 protein levels

表7 過表達(dá)STEAP1對PCNA、Vimentin、MMP9蛋白表達(dá)的影響Tab.7 Effect of overexpressed STEAP1 on PCNA，Vimen-tin and MMP9 protein

表8 沉默STEAP1對PCNA、Vimentin、MMP9蛋白表達(dá)的影響Tab.8 Effect of silence of STEAP1 on PCNA，Vimentin and MMP9 protein

2.5過表達(dá)和沉默STEAP1對BT549細(xì)胞Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平的影響 與BC組和NC組相比，LV-STEAP1組細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，siR-STEAP1組細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)，見表9、圖9和表10、圖10。

圖9 過表達(dá)STEAP1對Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平的影響Fig.9 Western blot for effect of overexpressed on Wnt,β-catenin and E-cadherin protein levels

圖10 沉默STEAP1表達(dá)對Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平的影響Fig.10 Western blot for effect of silence of STEAP1 on Wnt,β-catenin and E-cadherin protein levels

表9 過表達(dá)STEAP1對Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平的影響Tab.9 Effect of overexpressed STEAP1 on Wnt,β-catenin and E-cadherin protein

表10 沉默STEAP1對Wnt、β-catenin、E-cadherin蛋白水平的影響Tab.10 Effect of silence of STEAP1 on Wnt,β-catenin and E-cadherin protein

3 討論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受表觀遺傳、基因改變及微環(huán)境變化等因素影響，癌基因和原癌基因的轉(zhuǎn)變在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5，6]。STEAP1主要位于細(xì)胞膜，是細(xì)胞表面抗原，在膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用[7-10]。隨著研究深入，STEAP1在乳腺癌組織中的表達(dá)受到關(guān)注。如Xie等[11]研究發(fā)現(xiàn)STEAP1在人乳腺癌中的表達(dá)低于正常乳腺組織，在乳腺癌MCF-7、BT549等細(xì)胞中表達(dá)低于正常乳腺上皮細(xì)胞，敲低STEAP1表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，但不影響乳腺癌細(xì)胞增殖，表明STEAP1可能參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展，可能發(fā)揮抑癌基因作用。本文對乳腺癌BT549細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STEAP1可抑制乳腺癌BT549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，沉默STEAP1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞BT549增殖、侵襲和遷移，表明STEAP1在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，與既往研究結(jié)論一致。但既往研究發(fā)現(xiàn)STEAP1對乳腺癌細(xì)胞增殖無明顯影響，而本文發(fā)現(xiàn)STEAP1可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，原因可能為研究方法不完全相同，尚需進(jìn)一步研究。PCNA、Vimentin、MMP9與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移關(guān)系密切，其表達(dá)水平下降可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STEAP1可抑制乳腺癌BT549細(xì)胞中PCNA、Vimentin、MMP9蛋白表達(dá)，沉默STEAP1可促進(jìn)乳腺癌BT549細(xì)胞中PCNA、Vimentin、MMP9蛋白表達(dá)，表明STEAP1可抑制乳腺癌BT549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

侵襲和遷移為乳腺癌的主要特征，乳腺癌轉(zhuǎn)移不僅受細(xì)胞遺傳特性驅(qū)動，還受腫瘤微環(huán)境(細(xì)胞黏附、血管生成等因素)影響。乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲能力、侵入基底膜是乳腺癌轉(zhuǎn)移的開始，乳腺癌細(xì)胞脫離乳腺癌組織后穿透基底膜，向周邊浸潤生長，并通過淋巴管、血管等輸送至靶器官，黏附于靶器官內(nèi)皮細(xì)胞，穿透基底膜進(jìn)入靶器官間質(zhì)，并于靶器官生長和增殖，形成乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15,16]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchynal transition,EMT)在乳腺癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療中發(fā)揮重要作用，上皮細(xì)胞具有極性，且細(xì)胞間連接緊密，可限制細(xì)胞移動，在EMT過程中，細(xì)胞形狀和骨架發(fā)生變化，上皮細(xì)胞極性喪失，運(yùn)動性增強(qiáng)，獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征，增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力[17]。Xie等[11]研究發(fā)現(xiàn)敲低STEAP1表達(dá)在增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的同時上調(diào)EMT相關(guān)基因MMP2、MMP9、MMP13等表達(dá)，反之，增強(qiáng)STEAP1表達(dá)在顯著抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力的同時降低EMT相關(guān)基因表達(dá)，表明STEAP1抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移與其抑制乳腺癌細(xì)胞EMT有關(guān)。但STEAP1抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的機(jī)制尚未明確。

Wnt/β-catenin信號通路在惡性腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在EMT中也發(fā)揮重要作用，阻斷Wnt/β-catenin信號通路可抑制乳腺癌EMT，抑制乳腺癌侵襲遷移[18-20]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號通路的核心因子，Wnt可抑制β-catenin磷酸化降解，降低β-catenin復(fù)合物穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中β-catenin累積，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)下游基因表達(dá)。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中與E-cadherin蛋白結(jié)合，形成黏附性連接，E-cadherin水平下降可減弱細(xì)胞黏附力，提高惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[21，22]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STEAP1可降低乳腺癌BT549細(xì)胞中Wnt、β-catenin蛋白水平，上調(diào)E-cadherin蛋白水平，沉默STEAP1可上調(diào)乳腺癌BT549細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白水平，降低E-cadherin蛋白水平。表明STEAP1可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低細(xì)胞質(zhì)β-catenin水平，與E-cadherin蛋白結(jié)合減少，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中E-cadherin蛋白水平升高，形成細(xì)胞間黏附力，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，STEAP1在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，上調(diào)STEAP1表達(dá)可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。