何 強(qiáng) 尹 宏 代鳳雷 張 斌 徐 磊

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210022)

膝骨關(guān)節(jié)炎是由多種原因?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨進(jìn)行性退化，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降及巨大的人力和經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。關(guān)節(jié)軟骨由廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)組成，在膝骨關(guān)節(jié)炎的病變過程中，滑膜組織釋放的促炎因子分解、代謝、活化，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凈降解，加速膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[3]。膝骨關(guān)節(jié)炎的癥狀主要表現(xiàn)為疼痛。目前的臨床治療策略效果有限，肌肉的強(qiáng)健和運(yùn)動沒有得到充分重視，且現(xiàn)有用藥策略副作用較大，尤其是對于老年人群，如乙酰氨基酚的肝毒性、非甾體抗炎藥的胃腸道毒性以及阿片類藥物引起的跌倒、骨折和神經(jīng)錯(cuò)亂等[4]。膝骨關(guān)節(jié)炎的MRI研究已經(jīng)報(bào)道了滑膜炎和疼痛的關(guān)系，表明膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛是由炎癥觸發(fā)的,意味著抗炎治療策略可能減輕患者疼痛并改善關(guān)節(jié)功能[5，6]?；谀壳坝盟幉呗缘亩靖弊饔蔑L(fēng)險(xiǎn)，本研究試圖探討不同濃度的地黃梓醇在膝骨關(guān)節(jié)炎治療早期能否通過影響滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達(dá)而發(fā)揮作用，探究地黃梓醇治療早期膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 3～8周齡成年雄性Wistar大鼠40只，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，體質(zhì)量(0.29±0.1)kg。實(shí)驗(yàn)人員均獲得江蘇省動物實(shí)驗(yàn)資格證。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南京市六合區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2試劑 Galectin抗體(Proteintech，貨號：14979-I-AP，批號：10006432)；IL-1β抗體(Proteintech，貨號：66737-I-Ig，批號：10006432)；S100A12抗體(Bioworld，貨號：BS7539，批號：XS20181105000)；地黃梓醇(西安明朗科技生物有限公司)；4%木瓜蛋白酶 (上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶(Bioworld，貨號：BS10950，批號：CI33171)；辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司，批號：033016160503)；乙醇(成都市科龍化工試劑廠，批號：2015082701)；鹽酸(成都市科龍化工試劑廠，批號：20140706512)；蘇木素(無錫市江源實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司，批號：160401100)；中性樹脂(康復(fù)器材有限公司，批號：20150710)；石蠟(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20140626)；二甲苯(成都市科龍化工試劑廠，批號：2015072801)。

1.1.3儀器 分析天平(北京塞多利斯科儀器有限公司，型號：BSA124S)；烘箱(上海巴姆測控技術(shù)有限公司，型號：101-2AS)；蒸餾水制水器(上海亞榮生化儀器廠，型號：SZ-97A)；超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司，型號：Master-D UVF)；石蠟切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠，型號：YD-1508A)；光學(xué)顯微鏡(蔡司公司，型號：Axioplan 2 imaging)；水浴鍋(鄭州博科儀器設(shè)備有限公司，型號：HW-5L)；三維CT(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院影像學(xué)科提供，型號：Siemens Ddfintion AS)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，精準(zhǔn)稱重，按體質(zhì)量由小到大順序進(jìn)行編號，隨機(jī)分成4組：正常對照組、模型對照組、地黃梓醇低、高劑量組。除正常對照組外，其他3組造模期間統(tǒng)稱造模組。造模方法參照文獻(xiàn)[7-10]，木瓜蛋白酶法誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎，于實(shí)驗(yàn)開始后第1、4、7天分別向大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶。注射方法：麻醉前禁食12 h，按大鼠體質(zhì)量(5 ml/kg)采用體積分?jǐn)?shù)7%的水合氯醛注射于腹腔進(jìn)行麻醉，大鼠反抗能力減弱即為麻醉顯效。大鼠進(jìn)入淺麻醉期后，將其身體側(cè)臥并伸展左后肢，常規(guī)備皮、乙醇消毒，左膝關(guān)節(jié)屈曲45°,于髕骨下極髕腱外緣處，將4%木瓜蛋白酶100 μl注入大鼠左膝關(guān)節(jié)腔，誘導(dǎo)大鼠早期膝骨關(guān)節(jié)炎。見圖1。正常對照組處理方法及注射部位與造模組大鼠相同，左膝關(guān)節(jié)腔注射等體積生理鹽水。造模第10天，隨機(jī)選取造模組和正常對照組大鼠各4只，采用三維CT進(jìn)行模型鑒定，鑒定過程參考文獻(xiàn)[11]。

圖1 大鼠左膝關(guān)節(jié)腔注射相應(yīng)藥物過程Fig.1 Process of injecting corresponding drugs into left knee joint cavityNote:A.Shaving disinfection before injection;B.Injection of medicine into left knee joint;C.After injection.

1.2.2給藥方式 依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》劑量估換計(jì)算公式：dB=dA×KB/KA，將推薦成人每天服藥量折算為實(shí)驗(yàn)大鼠每天服藥量[12]。同時(shí)結(jié)合劉志強(qiáng)等[13]報(bào)道的梓醇不同給藥方式藥動學(xué)研究制定實(shí)驗(yàn)大鼠每天服藥量及服藥方式。地黃梓醇高劑量組采用100 mg/kg，地黃梓醇低劑量組10 mg/kg，每只大鼠灌胃給予0.2 ml/kg藥物。正常對照組和實(shí)驗(yàn)對照組給予等量生理鹽水。1次/d(早8：00)，連續(xù)28 d。

1.2.3標(biāo)本采集 滑膜組織采集參考文獻(xiàn)[14]。藥物干預(yù)完成后，過量麻醉處死大鼠(心臟注射過量7%水合氯醛)，10%強(qiáng)力消毒冷溶液完全浸泡10 min,置于超凈工作臺,仰位并固定,常規(guī)消毒。左后肢內(nèi)側(cè)打開左膝關(guān)節(jié)腔，由髕骨下緣向上延至可見一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完全剝離滑膜組織后完整切下。PBS沖洗干凈后放入一次性塑料包埋框中標(biāo)記，依順序放入不同濃度梯度的乙醇中脫水2 h；50%乙醇、二甲苯各透明2 h，浸蠟與包埋后切6 μm片，制成玻片后于60℃恒溫烘箱中烘烤約5 h，4℃保存待用。見圖2。

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜提取及部分玻片、蠟塊Fig.2 Extraction of synovium of rat knee joint and some slides and wax blocksNote:A.Synovium extracted from knee joint of rats;B.Prepared part;C.Wax block after being made.

1.2.4三維CT觀察 隨機(jī)抽取正常對照組和造模組各4只大鼠左膝關(guān)節(jié)的三維CT影像，以確定造模成功。

1.2.5S100A12、IL-1β、Galectin-3水平檢測 將切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，3%H2O2滅活切片中的內(nèi)源性過氧化物酶，放入95℃ 0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，孵育20 min以上，室溫放置至少20 min；PBS配制5%的正常山羊血清，37℃孵育10 min，甩去多余液體；按說明書采用5%BSA稀釋一抗和二抗，滴加一抗150 μl，室溫靜置1 h，4℃過夜后37℃復(fù)溫45 min；PBS洗3次，5 min/次，滴加二抗150 μl，室溫靜置1 h；PBS洗3次，5 min/次，滴加DAB顯色液150 μl，在顯微鏡下掌握染色程度，肉眼可見樣本變成棕黃色；染色程度合適時(shí)，立刻用PBS沖洗10 min。常規(guī)蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)染色情況，染色陽性采用光密度平均值評價(jià)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠左膝關(guān)節(jié)三維CT情況 正常對照組大鼠左膝間隙清晰正常，未見狹窄，關(guān)節(jié)骨質(zhì)邊緣光滑平整，造模組大鼠左膝關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，有清晰骨贅生成，骨質(zhì)邊緣和關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，見圖3。

圖3 大鼠左膝關(guān)節(jié)三維CTFig.3 Three dimensional CT of left knee joint of rats

2.2各組大鼠滑膜組織細(xì)胞中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達(dá)情況 正常大鼠滑膜組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中棕褐色顆粒較少，S100A12、IL-1β、Galectin-3無表達(dá)。模型對照組大鼠滑膜組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中棕褐色顆粒較對照組明顯增多。地黃梓醇各劑量組大鼠滑膜組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中棕褐色顆粒表達(dá)均較模型對照組減少，但地黃梓醇高劑量組較低劑量組減少更為明顯,見圖4。

圖4 各組大鼠滑膜組織細(xì)胞中S100A12、IL-1β、Galectin-3顯微鏡下觀察(×200)Fig.4 Observation of S100A12，IL-1β，Galectin-3 in synovial cells of rats in each group under microscope(×200)Note:A.Normal control group;B.Model control group;C.Catalpol low dose group;D.Catalpol high dose group.

2.3免疫組化法檢測各組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達(dá) 正常對照組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較低，模型對照組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)；地黃梓醇低劑量組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較模型對照組有所降低(P<0.05)；地黃梓醇高劑量組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較模型對照組明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 免疫組化法檢測各組大鼠滑膜組織中IL-1β、Galectin-3、S100A12水平表達(dá)Tab.1 Expressions of IL-1β,Galectin-3 and S100A12 in synovium of rats in each group was detected by

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是中老年的常見病和多發(fā)病，病理學(xué)特征為進(jìn)行性加重的關(guān)節(jié)軟骨退化、骨贅形成、軟骨下骨囊腫、關(guān)節(jié)間隙變窄和關(guān)節(jié)組織間歇性炎癥反應(yīng)等[15，16]。膝骨關(guān)節(jié)炎患者的主訴是反復(fù)加重性關(guān)節(jié)疼痛，嚴(yán)重降低患者的日常生活活動能力和生活質(zhì)量[17]。目前膝骨關(guān)節(jié)炎的保守治療策略都是基于消炎鎮(zhèn)痛藥的癥狀管理，尚無藥物可影響疾病進(jìn)展的研究[18]。在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的各種原因中，炎癥是軟骨代謝途徑失衡的最重要因素，導(dǎo)致機(jī)體失衡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解[19]。此前本課題組圍繞致炎因子與膝骨關(guān)節(jié)炎、髖骨關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展進(jìn)行了大量臨床研究[20-22]。

有研究表明炎癥反應(yīng)可能在膝骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛發(fā)展中起重要作用，局部非甾體類抗炎藥被國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)指南推薦用于所有膝骨關(guān)節(jié)炎患者[17]。據(jù)報(bào)道，在安大略省西部和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)中，滑膜炎與膝關(guān)節(jié)疼痛嚴(yán)重程度密切相關(guān)[23,24]。同時(shí)，在縱向研究中，Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)骨髓病變和滑膜炎的變化與膝關(guān)節(jié)疼痛的波動有關(guān)，當(dāng)骨髓病變較小時(shí)疼痛緩解的頻率更高。數(shù)據(jù)表明，滑膜組織和軟骨下骨受損時(shí)可能在確定膝關(guān)節(jié)疼痛的波動中起關(guān)鍵作用。有研究表明滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3 3種致炎因子在早期膝骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展過程中起重要作用[26-28]。

本課題組曾研究過膝骨關(guān)節(jié)炎患者血液及關(guān)節(jié)外組織中分泌的S100A12進(jìn)入血液循環(huán)后，可到達(dá)患者的關(guān)節(jié)周圍組織，如滑膜，促發(fā)滑膜炎；與既往研究類似，S100A12具有炎癥趨化作用，參與滑膜炎癥損傷，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨及關(guān)節(jié)骨破壞和骨增生；且患者骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度與S100A12的表達(dá)呈正相關(guān)[21]。本課題組之前研究顯示髖骨關(guān)節(jié)炎患者具有相同的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果[22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-1β在膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中大量表達(dá)[29]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)IL-1β水平越高其骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度越高[30]。有研究表明Galectin-3是關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)劑，可通過促炎作用加速骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[31，32]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究表明Galectin-3水平越高，骨關(guān)節(jié)炎越嚴(yán)重[33]。S100A12在炎癥環(huán)境下可驅(qū)動膝骨關(guān)節(jié)炎中IL-1β水平升高[34]。有研究表明Galectin-3是細(xì)胞中IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)放大器[35]。促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)可影響Galectin-3水平而加速依賴性小梁骨丟失和骨強(qiáng)度降低，加速膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[36]。

地黃是傳統(tǒng)四大懷藥之一，熟地黃主歸肝、腎兩經(jīng),具有補(bǔ)陰血、益腎精的功效?！侗静菥V目》中“填骨髓、長肌肉、生精血”的描述肯定了熟地黃對筋骨肌肉虛勞諸證的補(bǔ)益作用。目前熟地黃在臨床上已被廣泛用于炎癥治療[37]。地黃梓醇是從地黃中提取的一種環(huán)烯醚萜苷化合物，2015 版《中國藥典》明確規(guī)定地黃梓醇作為地黃質(zhì)量控制的指標(biāo)[38]。地黃梓醇的藥理作用包括抗細(xì)胞凋亡、抗炎等，但缺少相應(yīng)的基礎(chǔ)研究支持[39]。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同濃度地黃梓醇對木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型滑膜中S100A12、IL-1β、Galectin-3的表達(dá)水平，結(jié)果表明不同濃度地黃梓醇均能降低膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中IL-1β、Galectin-3、S100A12表達(dá)，且地黃梓醇高劑量組較低劑量組效果更為明顯，地黃梓醇通過抑制早期膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子的釋放阻止軟骨基質(zhì)降解，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

基于本課題組既往臨床試驗(yàn)研究結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)取得了以下新進(jìn)展：①本次動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)炎癥細(xì)胞因子S100A12表達(dá)與早期膝骨關(guān)節(jié)炎具有相關(guān)性；②實(shí)現(xiàn)了從單個(gè)炎癥細(xì)胞因子S100A12水平的研究到多個(gè)炎癥細(xì)胞因子S100A12、IL-1β、Galectin-3水平研究；③將傳統(tǒng)中藥地黃應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究，并探討地黃梓醇對于早期膝骨關(guān)節(jié)炎治療的可行性。完善了臨床研究的不足，同時(shí)完善了目前地黃臨床應(yīng)用缺乏相應(yīng)基礎(chǔ)研究支持的不足?；谝陨涎芯考澳壳跋ス顷P(guān)節(jié)炎治療現(xiàn)狀，課題組將進(jìn)一步研究以中醫(yī)理論“腎主骨”和“治腎亦治骨”為指導(dǎo)，參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》將膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)行分型，不同證型采用不同中醫(yī)經(jīng)典方劑的臨床研究。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未闡明地黃梓醇膝骨性關(guān)節(jié)炎治療的最佳濃度及地黃梓醇是否可促進(jìn)軟骨修復(fù)及改善關(guān)節(jié)生理功能。因此將進(jìn)一步探究地黃梓醇對早期膝骨關(guān)節(jié)炎信號通路的影響及以地黃為君藥的方劑臨床研究。