常 青 王 偉 楊增華 張 旭 李 紅 武 莎 許文勝

(內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，包頭 014010)

骨關(guān)節(jié)炎是中老年人常見的慢性退行性疾病，主要特征有細胞外基質(zhì)減少、軟骨細胞破損及關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)等。遺傳、肥胖、關(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)變形均能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。研究顯示，60歲以上的老年人中有10%以上患有關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、行動不便。目前骨關(guān)節(jié)炎的治療手段主要有手術(shù)治療和藥物治療，常用的藥物有非甾體藥物和對乙酰氨基酚，但長期使用會造成消化系統(tǒng)和腎損傷。因此尋找有效且副作用小的骨關(guān)節(jié)炎治療藥物，研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生機制具有重要意義。黃芩苷(baicalin,BA)是唇形科植物黃芩干燥根的重要有效成分之一，具有廣泛的藥理作用和重要的臨床應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)BA具有抗菌、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用[1,2]。據(jù)報道，BA能有效抑制類風濕關(guān)節(jié)滑膜炎模型大鼠的炎癥反應(yīng)，且對蛋清、角叉菜膠誘發(fā)的大鼠足腫脹有抑制作用[3-5]。但BA對關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響以及分子機制均未見報道。本文通過分離培養(yǎng)大鼠軟骨細胞，探究BA對白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)誘導后軟骨細胞凋亡、炎癥反應(yīng)的影響及其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 BA(純度>98%，CAS:21967-41-9)購自百靈威科技公司。

1.1.2試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)購自碧云天生物公司；Annexin-V/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海生工；NO檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠IL-6、TNF-α、ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物公司；大鼠前列腺素E2(prostaglandin E-2,PEG2) ELISA測定試劑盒購自上海通蔚生物科技公司；兔抗大鼠一抗基質(zhì)金屬蛋白酶1(metalloproteinase-1,MMP-1)、MMP-3、MMP-13、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、聚蛋白多糖酶5(A disintegrin and metalloprote-inase with thrombospondin motif 5,ADAMTS-5)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)、p-AKT、AKT、p-p65、p65均購自美國CST公司；山羊抗兔二抗購自武漢三鷹公司。

1.1.3實驗動物 雄性SD大鼠，4～6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蒙)2015-0001。

1.1.4儀器 酶標儀購自美國Thermo Labsystem公司；全自動酶標儀、流式細胞儀均購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1大鼠軟骨細胞的分離與培養(yǎng) 將大鼠脫頸椎處死。經(jīng)75%酒精浸泡后，置于無菌操作臺，取下雙側(cè)膝關(guān)節(jié)。75%酒精浸泡30 s，PBS洗3次，轉(zhuǎn)移至細胞操作臺。眼科剪和手術(shù)刀除去肌肉和肌腱，剝離關(guān)節(jié)滑膜，手術(shù)刀削下透明軟骨，PBS洗2次，剪碎后經(jīng)0.3%膠原酶消化3 h，過200目細胞篩后離心收集細胞。用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后更換培養(yǎng)基，細胞融合度達90%時，0.25%胰酶消化后重懸傳代。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 取軟骨細胞調(diào)整細胞密度至3×104個/ml，接種100 μl至96孔板，分為8組，用不同濃度BA處理(0、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L)，每組設(shè)置3個復孔，各組細胞在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度值。選擇無明顯細胞毒性的2個BA濃度進行后續(xù)實驗。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，將細胞分為Control組、IL-1β組、BA 5 μmol/L組和BA 10 μmol/L組。除Control組外，各組細胞均加入10 ng/ml的IL-1β處理24 h，然后在相應(yīng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次。加結(jié)合緩沖液，調(diào)整細胞密度至1×106個/ml，加入5 μl Annexin-V混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min后，加5 μl 碘化丙啶混勻上機檢測。

1.2.4ELISA試劑盒檢測NO及炎癥因子含量 分組和處理方法如1.2.3所述。胰酶消化收集各組細胞，加細胞裂解液冰上裂解，離心并收集上清。在酶標包被板中設(shè)置空白組、標準組和待檢樣品組。取50 μl樣品至酶標孔板底部，輕輕搖晃混勻。封膜后置于37℃的環(huán)境中溫育30 min，甩干，加入洗滌液靜置30 s后棄去，重復5次。除空白組外每孔加50 μl酶標試劑，37℃溫育30 min，洗5次。加50 μl顯色液，混勻后37℃避光反應(yīng)15 min，加50 μl終止液，450 nm處檢測吸光度值。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 分組和處理方法如1.2.3所述。胰酶消化收集各組細胞，加含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解后15 000 r/min離心10 min，收集上清。檢測上清中蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制作蛋白樣品，每孔上樣30 μg蛋白。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；轉(zhuǎn)移至一抗(1∶1 000)，4℃孵育12 h，洗膜緩沖液洗3次；轉(zhuǎn)移至二抗液(1∶2 000)，室溫下孵育1 h后，洗膜緩沖液洗3次，加顯影液，于成像系統(tǒng)中曝光。以β-actin為內(nèi)參，使用軟件ImagePro plus6.0分析蛋白條帶灰度。

1.3統(tǒng)計學分析 使用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0分析實驗數(shù)據(jù)。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度BA對大鼠軟骨細胞存活率的影響 不同濃度BA作用于大鼠軟骨細胞24 h后，細胞存活率如圖1，當BA濃度低于10 μmol/L時，大鼠軟骨細胞的存活率變化無統(tǒng)計學意義，經(jīng)計算，BA對大鼠軟骨細胞的半數(shù)抑制濃度為73 μmol/L。本文選擇無明顯細胞毒性的5、10 μmol/L進行后續(xù)實驗。

圖1 CCK-8檢測不同濃度BA對大鼠軟骨細胞存活率的影響Fig.1 CCK-8 was used to detect effect of BA at different concentrations on survival rate of chondrocytes in ratsNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs BA.

2.2BA緩解IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞凋亡 IL-1β誘導24 h后，檢測BA處理48 h對大鼠軟骨細胞凋亡的影響，結(jié)果如圖2，與Control組相比，IL-1β作用于大鼠軟骨細胞后，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與IL-1β組相比，BA處理組大鼠軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

圖2 流式細胞術(shù)檢測BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of BA on IL-1β-induced chondrocyte apoptosis in rats were detected by flow cytometryNote:**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IL-1β group.

2.3BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中NO和炎癥因子含量的影響 IL-1β誘導24 h后，檢測BA處理48 h對大鼠軟骨細胞NO和炎癥因子含量的影響，如圖3，與Control組相比，IL-1β作用于大鼠軟骨細胞后，細胞中NO、IL-6、PEG2和TNF-α的含量均顯著升高(P<0.01)；與IL-1β組相比，BA處理組大鼠軟骨細胞中NO、IL-6、PEG2和TNF-α的含量均顯著降低(P<0.01)。

圖3 BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中NO和炎癥因子含量影響Fig.3 Effect of BA on content of NO and inflammatory cytokines in rat chondrocytes induced by IL-1βNote:**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IL-1β group.

2.4BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中基質(zhì)降解蛋白表達水平的影響 IL-1β誘導24 h后，檢測BA處理48 h對大鼠軟骨細胞中基質(zhì)降解蛋白表達水平的影響，如圖4，與Control組相比，IL-1β作用于大鼠軟骨細胞后，細胞中MMP-1、MMP-3和MMP-13表達水平均顯著上升(P<0.01)；與IL-1β組相比，BA處理組大鼠軟骨細胞中MMP-1、MMP-3和MMP-13表達水平均顯著降低(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中基質(zhì)降解蛋白表達水平的影響Fig.4 Western blot was used to detect effect of BA on expression levels of matrix degradation proteins in rat chondrocytes induced by IL-1βNote:1.Control；2.IL-1β；3.BA 5 μmol/L；4.BA 10 μmol/L.**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IL-1β group.

2.5BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中iNOS、COX-2和ADAMTS-5表達水平的影響 IL-1β誘導24 h后，檢測BA處理48 h對大鼠軟骨細胞相關(guān)蛋白表達水平的影響，如圖5，與Control組相比，IL-1β作用于大鼠軟骨細胞后，細胞中iNOS、COX-2和ADAMTS-5的表達水平顯著升高(P<0.01)；而與IL-1β組相比，BA處理組大鼠軟骨細胞中iNOS、COX-2和ADAMTS-5表達水平顯著降低(P<0.01)。

圖5 Western blot檢測BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中iNOS、COX-2和ADAMTS-5表達水平的影響Fig.5 Western blot was used to detect effect of BA on expression levels of iNOS、COX-2 and ADANTS-5 in rat chondrocytes induced by IL-1βNote:1.Control；2.IL-1β；3.BA 5 μmol/L；4.BA 10 μmol/L.**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IL-1β group.

2.6BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達水平的影響 IL-1β誘導24 h后，檢測BA處理48 h對大鼠軟骨細胞通路相關(guān)蛋白表達水平的影響，如圖6，與Control組相比，IL-1β作用于大鼠軟骨細胞后，細胞中PI3K、p-AKT/AKT和p-p65/p65的表達及比例均顯著上升(P<0.01)；與IL-1β組相比，BA處理組大鼠軟骨細胞中PI3K、p-AKT/AKT和p-p65/p65的表達及比例均顯著降低(P<0.01)。

圖6 Western blot檢測BA對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.6 Effects of BA on expression level of PI3K/AKT pathway related proteins in IL-1β-induced rat chondrocytes were detected by Western blotNote:1.Control；2.IL-1β；3.BA 5 μmol/L；4.BA 10 μmol/L.**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IL-1β group.

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨基質(zhì)和少量軟骨細胞組成，基質(zhì)中的主要成分有膠原蛋白、多糖和水。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞成分，與軟骨的形成、狀態(tài)維護和修復過程密切相關(guān)。骨關(guān)節(jié)的退行性改變主要包括軟骨細胞凋亡和細胞外基質(zhì)降解。IL-1β能單獨促進一系列炎癥因子的分泌，臨床研究顯示，在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜及軟骨組織中，IL-1β表達水平均上升[6]。本研究結(jié)果顯示，當BA的濃度高于10 μmol/L時,對大鼠軟骨細胞活性有明顯的抑制作用。因此在后續(xù)實驗中選擇濃度為5 μmol/L和10 μmol/L的BA作用于軟骨細胞，以排除高濃度BA抑制大鼠軟骨細胞活性對實驗結(jié)果的影響。

軟骨細胞凋亡是關(guān)節(jié)炎的重要病理因素之一，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中常發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的異常凋亡。本研究結(jié)果顯示，BA能抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，BA通過調(diào)節(jié)NF-κB和熱激蛋白72抑制脂多糖誘導的奶牛乳腺細胞的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[7]。此外，細胞中自由氧含量降低可能是軟骨細胞凋亡率降低的重要原因。NO是內(nèi)皮細胞舒張因子，能抑制線粒體呼吸鏈中的關(guān)鍵酶類，同時能氧化產(chǎn)生OH-和NO2自由基，進而產(chǎn)生細胞毒性，造成組織損傷。本研究結(jié)果顯示，BA抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中iNOS表達，從而降低細胞中NO含量。

在關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，軟骨細胞產(chǎn)生過量炎癥因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導致軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)炎。本研究結(jié)果顯示，BA抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中TNF-α、IL-6和PEG2表達。TNF-α能促進PEG2和MMPs的表達，從而對軟骨細胞和細胞外基質(zhì)造成損傷。IL-6能抑制軟骨糖蛋白合成，促進基質(zhì)降解。大量研究顯示，BA具有抗炎作用，如改善咪喹默特誘導的小鼠銀屑樣炎癥，緩解氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導的動脈粥樣硬化[8,9]。綜合實驗結(jié)果表明，BA抑制了IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞炎癥反應(yīng)，從而減輕炎癥性損傷。

細胞外基質(zhì)是軟骨維持張力、抗壓及降低摩擦阻力的關(guān)鍵，其主要由軟骨細胞構(gòu)成。MMP-3和MMP-13能特異性降解細胞外基質(zhì)的主要成分——2型膠原蛋白和蛋白聚糖。在關(guān)節(jié)炎軟骨組織中，MMPs常過表達，其表達抑制有益于關(guān)節(jié)炎的治療。本研究結(jié)果顯示，BA作用于IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞后，細胞中MMP-1、MMP-3和MMP-13表達水平顯著降低。越來越多的研究表明，ADAMTS家族在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織的降解過程中發(fā)揮重要作用。ADAMTS-5是降解聚蛋白多糖的關(guān)鍵酶。據(jù)文獻報道，抑制或敲除ADAMTS-5對關(guān)節(jié)炎有預防和治療作用[10,11]。本研究結(jié)果顯示，BA抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中COX-2和ADAMTS-5的表達，進而減少大鼠軟骨細胞外基質(zhì)降解，從而維持關(guān)節(jié)正常結(jié)構(gòu)。

NF-κB信號通路對炎癥性疾病起重要作用，在骨關(guān)節(jié)炎細胞中，NF-κB p65磷酸化水平升高，AKT下游的NF-κB是調(diào)節(jié)細胞免疫的關(guān)鍵蛋白，能進一步調(diào)控下游TNF-α等炎癥細胞因子和MMPs的表達。因此，抑制NF-κB的磷酸化激活，能有效抑制TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子產(chǎn)生，從而改善炎癥性損傷[12-14]。在對椎間盤的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1、IL-4和TNF-β的表達有助于基質(zhì)降解、炎癥發(fā)生及其神經(jīng)傳遞，在椎間盤細胞凋亡中也發(fā)揮重要作用[15]。此外，抑制PI3K/AKT/NF-κB通路被認為是關(guān)節(jié)炎的治療方法之一[16]。本實驗結(jié)果顯示，BA作用于IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞后，細胞中PI3K、p-AKT和p-p65的表達水平顯著降低。Wang等[17]研究顯示，遠志皂苷通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制IL-1β誘導的人軟骨細胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本文通過IL-1β誘導大鼠軟骨細胞模擬骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的炎癥環(huán)境，結(jié)果顯示BA抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/NF-κB通路磷酸化激活有關(guān)。本研究為BA的臨床使用提供理論基礎(chǔ)，但其在動物實驗水平能否產(chǎn)生相應(yīng)作用仍需深入研究。