李亞梅 王燕俠

(甘肅省婦幼保健院科研中心，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診所，蘭州 730000)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種在妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等癥狀的多系統(tǒng)疾病。PE在孕婦中的發(fā)生率約為2%～8%，是導(dǎo)致早產(chǎn)、新生兒和產(chǎn)婦死亡的主要原因[1]。然而，對PE的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，目前尚缺乏對其的有效治療方法[2]。正常妊娠會引起輕度的全身炎癥反應(yīng)，而PE與過度的炎癥反應(yīng)相關(guān)[3]。來自動(dòng)物和人類研究的數(shù)據(jù)顯示，炎癥介質(zhì)在PE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。臨床研究表明，PE婦女比正常血壓婦女表現(xiàn)出更高的血清和胎盤促炎輔助性Th1細(xì)胞因子水平[5]。此外，研究表明母體通過核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)激活免疫細(xì)胞是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑[6]。

越來越多的證據(jù)表明，迷走神經(jīng)可以有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，迷走神經(jīng)被稱為膽堿能或煙堿類抗炎途徑[7-9]。α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)在該調(diào)節(jié)途徑中起關(guān)鍵作用[10]。黃芩苷是一種中藥，具有多種抗炎和抗凋亡的潛在生物學(xué)功能[11,12]。然而，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷對PE大鼠膽堿能抗炎途徑的調(diào)節(jié)作用。本文主要研究黃芩苷對PE大鼠的影響及其對膽堿能抗炎途徑的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究已獲得倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審查批件(FJ/04-IRB/C/018-V3.0)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用原則進(jìn)行。70只8～10周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g購自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)溫度23～26℃，相對濕度50%～60%，上午6：00～下午18：00之間給予光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并自由飲水。將雌性大鼠與可育的雄性大鼠交配過夜。陽性的陰道涂片確定為妊娠的第0天(gestation day 0,GD 0)。大鼠陰道分泌物涂片如圖1所示。

圖1 大鼠陰道分泌物中的精子Fig.1 Sperm in vaginal secretion of rats

1.1.2主要試劑與儀器 黃芩苷(baicalin，Bai)和LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；膽堿能拮抗劑α-bungarotoxin購自德國merck millipore公司；TNF-α、IL-1β、IL-6的Bio-Plex Pro Rat Cytokine 8-Plex Panel Luminex試劑盒購自美國Bio-Rad公司；RNeasy mini試劑盒、Quantitect反轉(zhuǎn)錄試劑盒、QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司；α7nAChR的大鼠單克隆抗體、山羊抗大鼠二抗購自美國Abcam公司。分光光度計(jì)、ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購自美國Thermo Scientifc公司；LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國羅氏公司。

1.2方法

1.2.1分組與建模 70只SD大鼠隨機(jī)平均分為7組：未妊娠組(NP)、妊娠組(P)、妊娠+黃芩苷組(P+Bai)、妊娠+α-bungarotoxin組(P+α-bun)、子癇前期組(PE)、子癇前期+黃芩苷組(PE+Bai)和子癇前期+α-bungarotoxin +黃芩苷組(PE+α-bun+Bai)。參考文獻(xiàn)[13]所述方法，在GD 14時(shí)，將2 ml的LPS(1 mg/kg)無菌鹽水溶液通過輸液泵注入大鼠尾靜脈 (輸注速度為2 ml/h) 來誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性PE大鼠模型。GD 14～GD 19時(shí)，P+Bai組、 PE+Bai組和PE+α-bun+Bai 組大鼠腹腔注射100 mg/kg·d的黃芩苷。在黃芩苷注射前30 min分別對P+α-bun組和PE+α-bun+Bai組大鼠腹腔注射1 mg/kg·d的α-bungarotoxin。對照組大鼠在相同的時(shí)間注射等體積的生理鹽水溶液(0.9%NaCl)。

1.2.2收縮壓(systolic blood pressure,SBP)的測定 使用美國KENT公司CODA系列動(dòng)物無創(chuàng)血壓測定系統(tǒng)通過容量壓力記錄法(VPR)在GD 6、11、14(LPS輸注前)、16和18(上午9：00～12：00)時(shí)測定大鼠SBP。每只大鼠進(jìn)行3次測定并記錄平均值。

1.2.3尿白蛋白的測定 在GD 7、12、17和19時(shí)，將大鼠放在單獨(dú)的代謝籠中24 h以獲取尿液樣本。尿液樣品在室溫下2 000 r/min離心15 min，并將上清液保存在20℃下用于后續(xù)的蛋白質(zhì)水平分析。使用全自動(dòng)生化分析儀測定尿蛋白濃度。在GD 20時(shí)，將大鼠麻醉，從下腔靜脈獲取血液樣本。取出胎鼠和胎盤并稱重。所有樣品均儲存于-80℃冰箱。

1.2.4Luminex檢測 60 mg胎盤組織于600 ml RIPA裂解緩沖液中勻漿并制備裂解物。試劑盒測定細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。根據(jù)說明書，以Luminex 200系統(tǒng)和Bioplex HTF進(jìn)行多次測定。使用Bio-Plex Manager 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并以濃度pg/(ml·mg)表示。

1.2.5RT-qPCR 研磨胎盤組織，RNeasy mini試劑盒提取總RNA。分光光度計(jì)測定RNA濃度。Quantitect反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA(500 ng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。QuantiFast SYBR Green PCR Kit進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。引物序列如下：α7nAChR 5′-CTCACAGCATGCAATCCAAGTACACTA-3′(F)，5′-CAGGACCGAAGGCTAAAAGAGCA-3′(R)。β-actin 5′-CCGGAGCTTCACCAATTGACACA-3′(F)，5′-CAGACGCAGGAGCAGTTAATCA-3′(R)。 以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)程序如下：95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 10 s變性，60℃ 30 s退火/延伸，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6Western blot分析 從胎盤中提取蛋白質(zhì)樣品。將樣品煮沸5 min，冰上冷卻，經(jīng)12% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。于Tris緩沖鹽水Tween 20中用5%脫脂牛奶封閉后，以抗α7nAChR的大鼠單克隆抗體(1：500稀釋度)4℃過夜孵育。將膜在含0.05%Tween 20的PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。將膜與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗(稀釋度為1∶3 000)于37℃孵育1 h，將膜在含0.05%Tween 20的PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。通過ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.7免疫組織化學(xué)測定 將大鼠胎盤組織固定于中性福爾馬林，石蠟包埋并制作3 μm厚切片，將切片微波處理以進(jìn)行抗原修復(fù)，并用0.3%H2O2進(jìn)行預(yù)處理，隨后將切片與山羊血清和含有兔抗NF-κBp65抗體的一抗共同4℃孵育過夜。使用HRP標(biāo)記的二抗37℃下孵育1 h，并用蘇木精復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織。 NF-κB活化程度表示為核NF-κBp65陽性細(xì)胞占胎盤細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1黃芩苷降低了PE大鼠的SBP 如圖2所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠在GD 16和18時(shí)SBP顯著升高(P<0.05)。用黃芩苷治療的PE+Bai組大鼠的SBP明顯低于PE組大鼠(P<0.05)。然而，PE+α-bun+Bai組大鼠的SBP值明顯高于PE+Bai組(P<0.05)。GD 6、GD 11和GD 14時(shí)各組SBP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠的SBP變化Fig.2 SBP changes of rats in each groupNote:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.2黃芩苷改善了PE大鼠的尿白蛋白水平 如圖3所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠在GD 17和GD 19時(shí)的平均24 h尿白蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠在GD 17和GD 19時(shí)的平均24 h尿白蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠在GD 17和GD 19時(shí)的平均24 h尿白蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠的尿白蛋白變化Fig.3 Urine albumin changes of rats in each groupNote:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.3黃芩苷降低了PE大鼠胎盤中的促炎細(xì)胞因子水平 如圖4所示，與NP組大鼠相比，P+α-bun組和PE組大鼠胎盤中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠胎盤中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠胎盤中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著升高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠胎盤中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平Fig.4 Levels of cytokines TNF-α,IL-1β and IL-6 in placenta of rats in each groupNote:1.NP；2.P；3.P+Bai;4.P+α-bun;5.PE；6.PE-Bai；7.PE+α-bun+Bai；compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.4黃芩苷增加了PE大鼠胎盤中α7nAChR表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示(圖5)，與NP組大鼠相比，PE+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與NP組大鼠相比，PE組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖5 各組大鼠胎盤中α7nAChR mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.5 α7nAChR mRNA and protein expressions in plac-enta of each group of ratsNote:1.NP；2.P；3.P+Bai;4.P+α-bun;5.PE；6.PE-Bai；7.PE+α-bun+Bai；compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.5黃芩苷抑制了PE大鼠胎盤中NF-κBp65的激活 如圖6所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠胎盤中核NF-κBp65的陽性細(xì)胞率顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組胎盤中核NF-κBp65的陽性細(xì)胞率顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組胎盤中核NF-κBp65的陽性細(xì)胞率顯著升高(P<0.05)。

圖6 免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠胎盤中NF-κBp65的表達(dá)(×400)Fig.6 Expression of NF-κBp65 in placenta of rats in each group detected by IHC staining(×400)Note:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

3 討論

PE的癥狀包括高血壓、蛋白尿、水腫等，并且伴隨全身異常的炎癥反應(yīng)，包括白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活[14]。最近，一些學(xué)者集中研究了抗炎干預(yù)在PE治療中的作用。高血壓大鼠在妊娠期用抗炎細(xì)胞因子IL-10治療可使血壓和尿蛋白排泄正常化并降低IFN-g水平[15]。用MgSO4處理可顯著降低LPS誘導(dǎo)的PE模型大鼠的TNF-α和IL-1β水平。免疫抑制劑環(huán)孢霉素A改善了PE大鼠模型的癥狀并減弱了炎癥反應(yīng)[14]。這些數(shù)據(jù)表明抗炎藥物可通過減弱炎癥反應(yīng)改善PE大鼠模型的臨床癥狀。

黃芩苷是一種天然植物藥，有研究報(bào)道黃芩苷可通過改變幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)來預(yù)防嚴(yán)重的急性胰腺炎，如Bax、Bcl-2和Caspase-3，還可預(yù)防鐵過量導(dǎo)致的肝、腎和心臟損傷[16，17]。以上結(jié)果表明黃芩苷可以保護(hù)心臟、肝臟和腎臟免受其他疾病引起的傷害。有研究表明黃芩苷在很大程度上降低了PE動(dòng)物模型的收縮壓和舒張壓癥狀，并降低尿蛋白水平[18]。黃芩苷通過抑制大鼠胎盤中的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡并通過調(diào)節(jié)X-連鎖凋亡抑制蛋白表達(dá)和下調(diào)Caspase-9表達(dá)改善線粒體的超微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療先兆子癇的作用[19]。在本研究中LPS誘導(dǎo)的PE妊娠大鼠模型中，黃芩苷可有效減輕SBP和尿蛋白排泄，并可抑制胎盤中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

據(jù)報(bào)道，膽堿能抗炎途徑可以抑制促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生[20]。越來越多的證據(jù)表明，α7nAChR在膽堿能抗炎途徑中至關(guān)重要。在人和大鼠胎盤中也觀察到了α7nAChR的表達(dá)。胎盤中內(nèi)源性釋放的乙酰膽堿(ACh)與巨噬細(xì)胞上的a7AChRs結(jié)合，從而抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生[21]。用α7nAChR激動(dòng)劑(如煙堿、PNU282987、GTS-21和膽堿)處理鼠巨噬細(xì)胞系可抑制促炎細(xì)胞因子[22]。本研究發(fā)現(xiàn)注射黃芩苷可提高胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白水平。同時(shí)，當(dāng)用α-bungarotoxin處理PE大鼠時(shí)，黃芩苷對PE大鼠的保護(hù)作用被抵消。α7nAChR可以控制NF-κB途徑。本研究表明，黃芩苷治療可抑制PE胎盤中核NF-κBp65表達(dá)，而α-bungarotoxin則顯著拮抗這些作用；黃芩苷通過膽堿能抗炎途徑減弱LPS誘導(dǎo)的PE大鼠模型中的炎癥反應(yīng)，從而改善PE樣癥狀的基礎(chǔ)。

綜上，黃芩苷通過激活α7nAChR從而激活了膽堿能抗炎性途徑，進(jìn)而減少PE大鼠模型癥狀，同時(shí)抑制了胎盤的炎癥。而應(yīng)用α7nAChR拮抗劑α-bungarotoxin處理則可逆轉(zhuǎn)黃芩苷的上述作用，表明激活膽堿能抗炎途徑可能有助于減輕PE，黃芩苷發(fā)揮的保護(hù)作用可能取決于其對α7nAChR的激活。