韋 玲 聞 明

(天津市泰達(dá)醫(yī)院，天津 300457)

心肌肥厚是心臟在生理性或者病理性刺激下發(fā)生的適應(yīng)性改變，可分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚[1]。生理性心肌肥厚是在妊娠、運(yùn)動(dòng)等生理性刺激下心肌細(xì)胞發(fā)生的代償性改變，心肌細(xì)胞沿著橫軸方向增大，可引起心臟收縮功能增強(qiáng)，但不會(huì)進(jìn)展為心力衰竭[2，3]；病理性心肌肥厚則是由心肌損傷、代謝紊亂、血管病變等病理性刺激誘發(fā)的心臟負(fù)荷超載的代償性改變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞沿著縱軸方向增大、心肌細(xì)胞收縮功能下降、蛋白質(zhì)合成增多、胚胎基因的重新激活以及心肌細(xì)胞的凋亡和心肌纖維化等不可逆改變，是心臟疾病向心力衰竭進(jìn)展的必然過程[4-6]。目前，心肌肥厚的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，臨床上尚缺乏有效的治療手段，因此，探索病理性心肌肥厚發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，改善病理性心肌肥厚的治療方案，對于人群健康具有重要意義。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中人及小鼠心肌肥厚組織的測序數(shù)據(jù)，借助R軟件篩選出目的基因Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，并通過后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究其對PE誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞肥大的影響及可能的作用機(jī)制，以期為探索新的抗心肌肥厚藥物治療靶點(diǎn)和策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PE購自英國Abcam公司；TLR4特異性siRNA序列(siTLR4)及對照組序列(siNeg)購自上海生工生物有限公司；TLR4過表達(dá)腺病毒(AdTLR4)及相應(yīng)對照組病毒(AdEGFP)購自上海漢恒生物科技有限公司；抗TLR4、IL-6、p-Stat3、t-Stat3和GAPDH一抗均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 選取出生后2～3 d的新生大鼠，斷頸處死后取出心臟組織，置于培養(yǎng)皿中，加入PBS緩沖液，洗滌后剪去心房組織。用剪刀將心臟組織剪碎，加入5 ml含0.1%的胰蛋白酶和0.04%的膠原酶Ⅱ的消化液，置于恒溫?fù)u床中，37℃消化20 min后，收集消化液，在剩余組織中添加消化液，繼續(xù)消化，重復(fù)4～5次，心臟組織消化完全后將收集的消化液混合，1 500 r/min 離心10 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，2 000目過濾后采用差時(shí)貼壁法去除成纖維細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105個(gè)/ml，接種在6孔板中，2 ml/孔，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 原代心肌細(xì)胞用冷PBS洗滌后用含1%ITS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將3 μl siRNA或5 μl Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑分別與100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基混合，室溫靜置5 min后，將siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合后靜置15 min，加入6孔板中。轉(zhuǎn)染后8 h換液，48 h收集細(xì)胞檢測敲低效率。腺病毒感染參照公司提供的相關(guān)步驟，即原代心肌細(xì)胞換液后，分別在每孔中加入對照組病毒和TLR4過表達(dá)病毒，感染24 h后換液，48 h收集細(xì)胞檢測過表達(dá)效率。細(xì)胞共分為4組：siNeg組、siTLR4組、AdEGFP組、AdTLR4組。

1.2.3WGA染色 原代心肌細(xì)胞用冷PBS浸洗3次，每次5 min，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次后，加入WGA(Wheat germ agglutinin)工作液，室溫下避光孵育30 min，PBS浸洗后，用0.2% Triton X-100通透10 min，使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，隨后使用正置顯微鏡進(jìn)行拍照，心肌細(xì)胞面積使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4qRT-PCR 原代心肌細(xì)胞用冷PBS洗滌后，加入1 ml Trizol，冰上裂解20 min后，用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，取0.5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因的mRNA水平，TLR4引物序列為：F：5′-TGGCATTGTTCCTTTCCTGC-3′，R：5′-GTTTAAGCCATGCCA-TGCCT-3′。β-actin引物序列為：F：5′-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3′，R：5′-AGGCATACAGGGACA-ACACA-3′。qRT-PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s,60℃ 20 s,70℃ 20 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，基因表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.5Western blot 原代心肌細(xì)胞用冷PBS洗滌2次后，RIPA上裂解30 min，用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞，提取總蛋白。取20 μg總蛋白行10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)膜封閉后將PVDF膜置入相應(yīng)的一抗中4℃孵育過夜，TBST洗滌2次后，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，使用ECL試劑盒進(jìn)行曝光分析。目的蛋白表達(dá)水平 =目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.6差異基因篩選 原始數(shù)據(jù)集GSE42955和GSE56348下載自GEO數(shù)據(jù)庫，使用R軟件及Limma功能包篩選差異表達(dá)基因，設(shè)置篩選條件為：|log2(Fold Change)|>0.5且P<0.05。使用及ggplot2等功能包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1心肌肥厚生物信息學(xué)分析 選取GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE42955，共含有17個(gè)人心臟組織樣本，其中正常心臟組織(Ctr)5個(gè)，擴(kuò)張性心肌病心臟組織(DCM)12個(gè)。對該數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，與正常心臟組織相比，DCM組織中有372個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中160個(gè)基因上調(diào)，212個(gè)基因下調(diào)(圖 1A)；選取數(shù)據(jù)集GSE56348，共含有10個(gè)小鼠心臟組織，其中假手術(shù)組心臟組織(Sham)5個(gè)，主動(dòng)脈縮窄手術(shù)組心臟組織(TAC)5個(gè)，對該數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，TAC組中有575個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中421個(gè)基因上調(diào)，154個(gè)基因下調(diào)(圖 1B)。

圖1 心肌肥厚組織生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of cardiomyocyte hyper-trophy tissues

2.2TLR4在心肌肥厚組織中高表達(dá) 對數(shù)據(jù)集GSE42955和GSE56348聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)， 共有32個(gè)基因表達(dá)水平在人和小鼠心肌肥厚組織中發(fā)生改變(圖 2A)。與正常心臟組織(Ctr)相比，擴(kuò)張性心肌病心臟組織(DCM)中TLR4表達(dá)水平顯著增加(P=0.014)(圖 2B)；與假手術(shù)組小鼠心臟組織(Sham)相比，主動(dòng)脈縮窄手術(shù)組小鼠心臟組織(TAC)中TLR4表達(dá)水平顯著增加(P=0.007 9)(圖 2C)。

圖2 TLR4在心肌細(xì)胞肥厚組織中高表達(dá)Fig.2 TLR4 is over-expressed in cardiomyocyte hyper-trophy tissues

2.3PE處理原代心肌細(xì)胞誘導(dǎo)TLR4表達(dá)增加 用PE處理原代心肌細(xì)胞48 h后，心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh7的mRNA水平顯著上升，Myh6的mRNA水平顯著降低(圖 3A)。心肌細(xì)胞面積分析發(fā)現(xiàn)，PE處理組心肌細(xì)胞面積顯著高于對照組心肌細(xì)胞(圖3B)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，PE處理48 h后，心肌細(xì)胞中TLR4基因mRNA和蛋白水平均顯著增加(圖3A、C、D)。

圖3 苯腎上腺素處理原代心肌細(xì)胞誘導(dǎo)TLR4表達(dá)上升Fig.3 Phenylephrine treatment induces increased expres-sion of TLR4 in primary cardiomyocytesNote:Compared with Control，*.P<0.05，**.P<0.01.

2.4敲低TLR4抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大 通過siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞，敲低TLR4表達(dá)水平，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，與siNeg組相比，siTLR4組心肌細(xì)胞中TLR4的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖 4A～C)。在PE處理下，敲低TLR4能逆轉(zhuǎn)PE導(dǎo)致的Anp和Bnp的mRNA水平升高(圖 4D、E)。心肌細(xì)胞面積分析發(fā)現(xiàn)，敲低TLR4能抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增加(圖 4F)。

圖4 敲低TLR4抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大Fig.4 Knock-down TLR4 inhibits PE-induced cardiomyo-cyte hypertrophyNote:Compared with siNeg，*.P<0.05，**.P<0.01;compared with control,##.P<0.01.

2.5過表達(dá)TLR4促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大 通過腺病毒感染的方式過表達(dá)心肌細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明， 與AdEGFP組相比，AdTLR4組心肌細(xì)胞中TLR4的mRNA和蛋白水平顯著增加(圖 5A～C)。在PE處理下，過表達(dá)TLR4能促進(jìn)PE導(dǎo)致的Anp和Bnp的mRNA水平升高(圖 5D、E)。心肌細(xì)胞面積分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TLR4能促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增加(圖 5F)。

圖5 過表達(dá)TLR4促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大Fig.5 Over-expression TLR4 promotes PE-induced cardiomyocyte hypertrophyNote:Compared with AdEGFP,*.P<0.05，**.P<0.01；compared with Control,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.6TLR4對IL-6/Stat3信號通路的影響 Western blot結(jié)果表明，PE處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3水平顯著上升，t-Stat3水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6A、C)。在PE處理下，敲低TLR4能引起心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3表達(dá)水平降低(圖 6A、B)，過表達(dá)TLR4能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3表達(dá)水平顯著上升(圖 6C、D)。

圖6 TLR4對IL-6/Stat3信號通路的影響Fig.6 Effect of TLR4 on IL-6/Stat3 signal pathwayNote:Compared with siNeg or AdEGFP，*.P<0.05，**.P<0.01；compared with siNeg+PE or AdEGFP+PE，#.P<0.05，##.P<0.01.

3 討論

TLR4屬于TLRs蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)，該家族共含有13種TLRs蛋白，均屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，由富含亮氨酸重復(fù)序列的胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，其中TLR4是哺乳動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的TLRs[7，8]。研究表明，TLR4在包括單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過識別包括熱休克蛋白、胎球蛋白A、纖連蛋白等在內(nèi)的內(nèi)源性配體和細(xì)菌脂多糖、核酸等外源性配體，激活下游信號通路而發(fā)揮重要功能，參與調(diào)控天然免疫和獲得性免疫過程，與腫瘤、心血管疾病、免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)[9-11]。既往大量研究表明，TLR4與冠心病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病密切相關(guān)，而TLR4與病理性心肌肥厚發(fā)生發(fā)展也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]。Li等[15]研究表明，長鏈非編碼RNA MIAT(myocardial infarction-associated transcript)可通過海綿吸附miRNA-93進(jìn)而上調(diào)TLR4的表達(dá)水平，從而促進(jìn)病理性心肌肥厚的發(fā)生。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，在壓力負(fù)荷下，NLRP3基因敲除能促進(jìn)小鼠發(fā)生病理性心肌肥厚，進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3敲除可引起TLR4高表達(dá)，TLR4抑制劑能緩解NLRP3基因敲除小鼠在壓力負(fù)荷下出現(xiàn)的心肌肥厚和心功能下降，這些研究均提示TLR4在病理性心肌肥厚中的重要作用，而具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE42955和GSE56348，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)正常心臟組織相比，在人和小鼠肥厚心臟組織中有32個(gè)基因表達(dá)水平均發(fā)生改變，其中，TLR4基因在人和小鼠肥厚心臟組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。隨后，本研究使用PE處理新生大鼠原代心肌細(xì)胞48 h，然后檢測Anp、Bnp、Myh6、Myh7等心肌肥厚的重要標(biāo)志物，并通過WGA染色及心肌細(xì)胞面積分析發(fā)現(xiàn)，PE能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，表明PE誘導(dǎo)的新生大鼠原代心肌細(xì)胞肥大模型成功建立。隨后，本研究檢測了PE處理48 h后，原代心肌細(xì)胞中TLR4基因蛋白和mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在PE刺激后，TLR4基因蛋白和mRNA水平均顯著增加。這些結(jié)果提示TLR4在心肌肥厚發(fā)生過程中具有重要作用，因此本研究選擇TLR4作為目的基因。為進(jìn)一步探究TLR4在心肌肥厚中的作用，本研究設(shè)計(jì)TLR4特異性siRNA和TLR4過表達(dá)腺病毒進(jìn)行細(xì)胞水平和分子水平的驗(yàn)證。結(jié)果表明，在PE處理下，敲低TLR4能逆轉(zhuǎn)PE導(dǎo)致的Anp和Bnp的mRNA水平升高。心肌細(xì)胞面積分析發(fā)現(xiàn)，敲低TLR4能抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增加，說明敲低TLR4能抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。相反，上調(diào)TLR4能顯著促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，這些結(jié)果表明，TLR4在心肌肥厚中具有重要作用。

IL-6是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的多效能細(xì)胞因子，通過與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)激活下游JAKs家族成員，包括絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activation protein kinase，MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PⅠ3K)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activator of transcri-ption 3,Stat3)，從而廣泛參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，參與惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展[17，18]。既往研究表明，IL-6/Stat3信號通路與病理性心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[19-21]。Chen等[19]發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚過程中伴隨著IL-6/Stat3信號通路依賴的炎癥反應(yīng)的激活；Chen等[20]研究表明，在血管緊張素Ⅱ處理下，IL-6基因敲除能緩解小鼠病理性心肌肥厚的發(fā)生，改善心功能；Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-6能減輕壓力超負(fù)荷引起的左心室肥大和功能障礙，與Stat3磷酸化水平降低有關(guān)，這些研究均表明，IL-6/Stat3信號通路在心肌肥厚發(fā)生中具有重要作用。因此，為進(jìn)一步探究TLR4作用機(jī)制，本研究檢測了TLR4敲低或者過表達(dá)對IL-6/Stat3信號通路的影響。結(jié)果表明，PE處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3水平顯著增加，t-Stat3水平無顯著改變，說明在肥厚刺激下，IL-6/Stat3信號通路處于激活狀態(tài)，這與既往研究相符。在基礎(chǔ)水平下，敲低或過表達(dá)TLR4對IL-6和p-Stat3水平無明顯影響，而在肥厚刺激下，敲低TLR4能引起心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3表達(dá)水平降低，過表達(dá)TLR4能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中IL-6和p-Stat3表達(dá)水平顯著增加，以上結(jié)果表明，TLR4可能是通過調(diào)控IL-6/Stat3信號通路從而影響病理性心肌肥厚的發(fā)生。不過，本研究尚未深入探究TLR4激活I(lǐng)L-6/Stat3信號通路的具體機(jī)制，也未能進(jìn)行逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抑制IL-6/Stat3信號通路活性能否減弱TLR4過表達(dá)對PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的促進(jìn)作用，有待進(jìn)一步探索。

總之，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)手段，篩選出與病理性心肌肥厚發(fā)生有關(guān)的基因TLR4，敲低TLR4可能是通過抑制IL-6/Stat3信號通路緩解PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生，TLR4可能是潛在的治療心肌肥厚藥物的作用靶點(diǎn)。