孫 濤 郭志華 曾 英

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，長(zhǎng)沙 410000)

心力衰竭(heart failure，HF)是由于心臟損傷引起的心排血量減少不能滿足機(jī)體代謝需要而引起的一系列綜合征，臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、倦怠和乏力等，在美國(guó)，每年有400億美元用于治療HF[1，2]。HF是以心肌細(xì)胞壞死導(dǎo)致心臟功能障礙的特異性疾病，其主要特點(diǎn)心肌細(xì)胞肥大、壞死及纖維化導(dǎo)致射血?jiǎng)恿Σ蛔?，心臟功能不全、HF等[3]。文獻(xiàn)報(bào)道稱造成HF的主要原因有炎癥感染、心肌細(xì)胞壞死、心肌能量代謝紊亂等，因此從上述因素尋找治療HF的手段，成為當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者不斷探尋的課題[4-6]。益心泰丸主要由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓等中藥組成，研究表明益心泰丸具有改善血流動(dòng)力、抑制心室重構(gòu)、減緩HF、抑制心肌凋亡、抑制炎癥因子等作用，但其作用機(jī)制尚未見有報(bào)道[7，8]。在細(xì)胞凋亡過程中，磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路對(duì)相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，可將膜受體信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，來(lái)實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡過程。作為Akt的底物，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件[9]。本研究采用HDR誘導(dǎo)的HF大鼠為模型，從PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路探討益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)的HF大鼠心功能的保護(hù)作用，從而為其臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): SCXK(湘)2009-0001。

1.1.2主要試劑 阿霉素購(gòu)自Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自博士德生物公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；兔抗鼠Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β、兔抗GAPDH以及山羊抗兔IgG采購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；PRA、AngⅡ、ALD 試劑盒購(gòu)自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1模型構(gòu)建和分組處理 實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼1周，隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為空白對(duì)照組，模型組、益心泰丸組和開博通組，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，腹腔注射2.5 mg/kgADR，48 h后二次注射ADR(2.5 mg/kg)構(gòu)建模型，彩超檢測(cè)心功能障礙時(shí)提示模型構(gòu)建成功，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，益心泰丸組和開博通組分別灌胃給予相應(yīng)藥物5 mg/kg，連續(xù)給藥4周。

1.2.2大鼠血漿內(nèi)PRA、AngⅡ、ALD含量變化情況檢測(cè) 給藥4周后空腹尾部采血，采用PRA、AngⅡ、ALD試劑盒檢測(cè)各指標(biāo)變化。

1.2.3超聲檢査心臟結(jié)構(gòu)的變化 給藥4周后，麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)，心臟彩超檢查心臟功能和心臟結(jié)構(gòu)情況。記錄左室收縮期(LVPWs)、舒張期后壁厚度(LVPWd)等數(shù)據(jù)。

1.2.4HW/BW檢測(cè) 大鼠處死后，打開胸腔暴露心臟，結(jié)扎取心臟，生理鹽水洗凈血液，吸水紙吸干，稱取心臟重量，計(jì)算HW/BW。

1.2.5HE染色觀察大鼠心肌組織的病理學(xué)改變 取新鮮心臟組織，生理鹽水洗滌，10%中性甲酸緩沖液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、銅質(zhì)模具包埋，連續(xù)切片4 μm 的組織切片，二甲苯脫蠟、水化 ，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，65℃ 2 h，生理鹽水沖洗，鹽酸酒精分化，PBS洗滌，伊紅染色，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.6TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 將大鼠心肌細(xì)胞石蠟切片，3%H2O2浸洗3次，PBS洗滌3次，0.01 mol/L TBS緩沖液沖洗，0.01 MTBS，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室溫水解15 min，PBS洗滌3次，加入含2%H2O2的PBS反應(yīng)10 min，PBS洗滌；然后加入TUNNEL反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)60 min，溫度37℃，PBS漂洗，加50 μl的 conberter-POD，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，溫度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反應(yīng)15 min，PBS漂洗，蘇木素復(fù)染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，5個(gè)高倍視野中凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量為細(xì)胞凋亡陽(yáng)性指數(shù)AI。

1.2.7ELISA法檢測(cè)血清TNF-α和IL-6的表達(dá) 給藥4周后尾部采血，2 000 r/min離心10 min，取上清按照ELISA試劑盒說明書操作檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6水平。

1.2.8Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β 凍存的心肌組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后，離心，離心條件：13 000 r/min，4℃，時(shí)間10 min，獲得上清液，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行上清液中蛋白濃度的定量檢測(cè)，用2倍電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應(yīng)一抗稀釋液(均為1∶1 000)中孵育，4℃過夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠血漿內(nèi) PRA、AngⅡ、ALD含量的影響 如圖1所示，模型組的PRA、AngⅡ、ALD水平顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。益心泰丸組和開博通組PRA、AngⅡ、ALD顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；益心泰丸組、開博通組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌厚度的影響 模型組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組和開博通組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌厚度的影響Fig.2 Effect of Yixintai Pill on myocardial thickness of ADR-induced HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05.

2.3益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 模型組大鼠心肌呈片狀壞死、空泡性變性、心肌纖維增多、心肌細(xì)胞片狀溶解；空白組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、少量成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；益心泰丸組和開博通組心肌纖維化、變性等較輕，肌纖維變性、纖維組織增生明顯減少，見圖3。

圖3 益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌組織病理學(xué)的影響Fig.3 Effect of Yixintai Pill on myocardial histopathology of ADR-induced HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group.

2.4益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞核呈棕黃色。與空白組相比，模型組AI數(shù)值明顯升高，益心泰丸組、開博通組與模型組相比AI數(shù)值均明顯下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 TUNEL染色檢測(cè)益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 TUNEL staining was used to detect effect of Yixintai Pill on myocardial cell apoptosis induced by ADR in HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group;compared with model group，*.P<0.05;compared with blank group,#.P<0.05.

2.5益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌細(xì)胞TNF-α和IL-6的影響 模型組的TNF-α和IL-6顯著高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組和開博通組的TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。

圖5 益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌細(xì)胞TNF-α和IL-6的影響Fig.5 Effect of Yixintai Pill on TNF-α and IL-6 in myoc-ardial cells of HF rats induced by ADRNote:Compared with blank group，#.P<0.05；compared with model group，*.P<0.05.

2.6益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β的影響 與空白組相比，模型組p-Akt、P-GSK-3β水平明顯下降，益心泰丸組和開博通組的p-Akt、P-GSK-3β顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 益心泰丸對(duì)ADR誘導(dǎo)HF大鼠心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的影響Fig.6 Effect of Yixintai Pill on myocardial Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β induced by ADR in HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05；compared with blank group，#.P<0.05.

3 討論

益心泰丸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、利尿、保肝、降壓、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心臟功能，調(diào)整心律，改善微循環(huán)等作用[10]。本研究采用ADR構(gòu)建HF模型，觀察益心泰丸治療HF的效果，結(jié)果顯示益心泰丸能夠明顯降低HF模型大鼠血漿內(nèi) PRA、AngⅡ、ALD的含量，證明益心泰丸可抑制RAAS 過度激活保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心臟功能。國(guó)內(nèi)學(xué)者楊明等[11]研究表明益心泰丸能能夠顯著降低HF模型大鼠血漿內(nèi)PRA、AngⅡ、ALD的含量，與本文研究結(jié)果一致。

HF是由于心肌細(xì)胞壞死導(dǎo)致心臟功能障礙，嚴(yán)重危害人們身體健康的一種疾病，其特點(diǎn)主要以心臟纖維壞死、心臟射血?jiǎng)恿Σ蛔?、心臟功能不全等癥狀為主[12]。文獻(xiàn)報(bào)道稱HF最先出現(xiàn)左心室功能損害，隨著病情的發(fā)展不斷惡化影響其他心肌結(jié)構(gòu)與功能，最終引起不可逆的心力衰竭[13]。本研究中的超聲結(jié)果顯示模型組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著高于空白對(duì)照組，提示心臟的左心室結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了損害，而益心泰丸組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明益心泰丸保護(hù)ADR大鼠的心臟功能。

HF發(fā)病機(jī)制尚不明確，文獻(xiàn)報(bào)道稱，心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)在 HF的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是HF發(fā)生重要因素之一，阻斷心肌細(xì)胞凋亡可以降低HF的發(fā)病率，延緩HF的發(fā)展速度，改善心臟各項(xiàng)功能[14，15]。本研究HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠心肌呈片狀壞死、空泡性變性、心肌纖維增多、心肌細(xì)胞片狀溶解，提示HF大鼠的心臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，而益心泰丸可以使心肌纖維化變性較輕，減少纖維組織增生。既往研究結(jié)果顯示益心泰丸可以明顯抑制心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡[16]。本研究中TUNNEL染色結(jié)果顯示HF組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯，凋亡指數(shù)明顯高于空白組，口服益心泰丸后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降。

研究表明PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的活化是心室重構(gòu)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，該信號(hào)通路激活與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示與空白組相比，模型組p-Akt、p-GSK-3β水平明顯下降，益心泰丸組和開博通組的p-Akt、p-GSK-3β顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從而提示PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路參與了HF的發(fā)生發(fā)展，采用益心泰丸處理后，p-Akt、p-GSK-3β水平明顯升高，說明益心泰丸可能是通過上調(diào)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路來(lái)保護(hù)HF的心臟功能。

綜上所述，益心泰丸可能通過上調(diào)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，抑制心室重構(gòu)，從而保護(hù)心臟功能。