程 琦 徐松濤 饒淑梅 馬永超

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，漯河 462002)

胃癌是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤之一。全世界每年死于胃癌的患者約78.3萬例，死亡率僅次于肺癌，位居惡性腫瘤譜第二位[1]。我國每年新增胃癌患者約67.9萬例，死亡49.8萬例，成為我國癌癥死亡的第二大原因[2]。90%以上癌癥患者的死亡是由腫瘤細胞侵襲和遠處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的[3]。因此侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌治療效果和生存預(yù)后的重要制約因素。托芬那酸(tolfenamic acid,TA)是一種廣泛應(yīng)用的非甾體抗炎藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等作用[4]。近年來，TA對癌癥的化學(xué)預(yù)防作用已獲大量臨床和流行病學(xué)證據(jù)支持[5]。多項研究證實，TA可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1 (specificity protein 1,SP1)表達發(fā)揮抗腫瘤作用，包括神經(jīng)母細胞瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、尤文肉瘤和胰腺癌等[6-10]。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)是受SP1調(diào)控的下游分子，在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。但目前關(guān)于TA對胃癌細胞遷移和侵襲的作用鮮有報道。本研究擬通過分子生物學(xué)方法觀察TA對人胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲的影響，并探究其可能的生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；TA購自Selleck公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；結(jié)晶紫染色液、TRIzol試劑、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購自Corning公司；靶向LOXL2的shRNA干擾質(zhì)粒(pRS-LOXL2)和無義對照質(zhì)粒(pRS-scrambled)購自美國Origene公司；脂質(zhì)體(Lipofectamine?2000)購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司；兔抗人SP1、LOXL2、Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Abcam公司；LOXL2、GAPDH引物由大連寶生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SGC-7901細胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2 d換液1次，待細胞覆蓋率達到90%時按1∶3比例傳代1次。

1.2.2藥物配制 將TA溶于二甲基亞砜(DMSO)制成100 mmol/L的儲備液。實驗前用完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，其中DMSO的終濃度為0.1%，對照組為含0.1% DMSO的細胞培養(yǎng)液。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 將SGC-7901細胞以5 000個/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h；去上清，加入100 μl含不同劑量TA(0、3、6、12、24、48、96 μmol/L)的細胞培養(yǎng)液，每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h或48 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處OD值；依據(jù)公式計算細胞活力，細胞活力(%)=(OD藥物組/OD對照組)×100%，采用SPSS18.0軟件的Probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.4Transwell法檢測細胞侵襲 以不同劑量TA(0、3、6、12 μmol/L)處理SGC-7901細胞24 h，然后收集各組細胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基制成密度為2×105個/ml的細胞懸液；用RPMI1640培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取50 μl加至上室底部，37℃孵育1 h；下室中加入600 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，上室中加入200 μl細胞懸液，在37℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h；用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min；顯微鏡下計數(shù)上室下表面附著的侵襲細胞。

1.2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine?2000將質(zhì)粒pRS-LOXL2和pRS-scrambled分別轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞，細胞轉(zhuǎn)染按說明書進行；轉(zhuǎn)染pRS-LOXL2質(zhì)粒的SGC-7901細胞命名為shLOXL2組，轉(zhuǎn)染pRS-scrambled質(zhì)粒的SGC-7901細胞命名為shControl組；轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.6RT-PCR檢測mRNA水平 用TRIzol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。取2 μl進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 1 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環(huán)。引物采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計，經(jīng)Blast驗證。LOXL2上游引物：5′-CTGCAAGTTCAATGCCGAGT-3′，下游引物：5′-AGTTTTGGCCACACACCATC-3′；GAPDH上游引物：5′-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3′，下游引物：5′-GGGCAGAGATGATGACCCTT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照。

1.2.7Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細胞，加入RIPA裂解細胞提取總蛋白，采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度；用5×上樣緩沖液稀釋蛋白樣本，沸水浴10 min，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗LOXL2(1∶1 000稀釋)、Snail(1∶1 000稀釋)、E-cad(1∶1 000稀釋)、MMP9(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜2次；加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜2次；加入ECL工作液進行發(fā)光反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析儀拍照。

2 結(jié)果

2.1TA對SGC-7901細胞活力的影響 如圖1所示，經(jīng)不同劑量TA作用24 h或48 h后，與對照組相比，24、48和96 μmol/L TA組細胞活力均顯著降低(P<0.05)，且隨藥物劑量的增加呈下降趨勢；3、6和12 μmol/L TA組細胞活力與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。24 h和48 h的IC50分別為78.06 μmol/L和50.72 μmol/L。

圖1 TA對SGC-7901細胞活力的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of TA on cell viability of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 24 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 48 μmol/L TA group.

2.2TA對SGC-7901細胞侵襲的影響 如圖2所示，與對照組相比，3、6和12 μmol/L TA組侵襲細胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，且隨著藥物劑量的增加而減少(P<0.05)。

圖2 TA抑制SGC-7901細胞侵襲Fig.2 TA suppressed invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.3TA對侵襲相關(guān)蛋白水平的影響 如圖3所示，與對照組相比，經(jīng)不同劑量TA(3、6、12 μmol/L)處理24 h后，SGC-7901細胞中Snail、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，且隨TA劑量的增加呈下降趨勢(P<0.05)；E-cad蛋白水平則隨TA劑量的增加逐漸升高(P<0.05)。

圖3 TA對SGC-7901細胞中Snail、E-cad、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平的影響Fig.3 Effect of TA on protein levels of Snail,E-cad,MMP9,SP1 and LOXL2 in SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.4TA對LOXL2的mRNA水平的影響 如圖4所示，與對照組相比，3、6和12 μmol/L TA組LOXL2的mRNA水平均顯著下降(P<0.05)，且隨TA劑量的增加呈下降趨勢(P<0.05)。

圖4 TA劑量依賴性下調(diào)LOXL2的mRNA水平Fig.4 TA down-regulated mRNA level of LOXL2 in a dose-dependent mannerNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.5敲除LOXL2基因?qū)η忠u相關(guān)蛋白水平的影響 如圖5所示，與shControl組相比，shLOXL2組LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，E-cad蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

圖5 敲除LOXL2基因?qū)OXL2、Snail、E-cad和MMP9蛋白水平的影響Fig.5 Effect of LOXL2 gene knockout on protein levels of LOXL2,Snail,E-cad and MMP9Note:*.P<0.05 vs shControl group.

2.6敲除LOXL2基因?qū)GC-7901細胞侵襲的影響 如圖6所示，與shControl組相比，shLOXL2組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。

圖6 敲除LOXL2基因抑制SGC-7901細胞侵襲Fig.6 Knockout of LOXL2 gene inhibited invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs shControl group.

3 討論

有研究證實，TA可通過下調(diào)Slug蛋白表達抑制人鼻咽癌細胞遷移和侵襲[14]。本研究顯示，高劑量TA(>12 μmol/L)對人胃癌SGC-7901細胞活力具有顯著抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。為避免細胞活力受損對細胞侵襲能力的影響，本實驗采用低劑量TA(3、6、12 μmol/L)處理SGC-7901細胞24 h，然后行Transwell實驗檢測細胞侵襲。結(jié)果顯示，TA可劑量依賴性地抑制SGC-7901細胞侵襲，這可能與其下調(diào)SP1、LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平，上調(diào)E-cad蛋白水平有關(guān)。

多項研究表明，LOXL2在惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，包括胰腺癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等[15-18]。Kasashima等[13]研究表明，胃癌病理組織中LOXL2蛋白水平與局部侵襲范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，敲除LOXL2基因可顯著抑制人胃癌OCUM-12細胞和NUGC細胞侵襲。動物實驗也證實，抑制LOXL2可阻止裸鼠胃癌移植瘤向肺轉(zhuǎn)移[12]。本研究顯示，TA可劑量依賴性地下調(diào)SGC-7901細胞中LOXL2的mRNA水平，敲除LOXL2基因可抑制SGC-7901細胞侵襲并下調(diào)Snail和MMP9蛋白水平并上調(diào)E-cad蛋白水平。

E-cad是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，其胞內(nèi)段通過連環(huán)素錨定在細胞骨架上，使相鄰細胞形成穩(wěn)定連接，其表達下調(diào)或缺失是腫瘤細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要標(biāo)志之一。研究表明，E-cad蛋白表達上升會導(dǎo)致癌細胞侵襲能力減弱[19]。敲除LOXL2基因可上調(diào)腎癌細胞中E-cad蛋白表達從而抑制其遷移和侵襲[17]。Snail是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可直接結(jié)合E-cad基因啟動子的E-box作用元件，從而抑制其表達[20]。LOXL2高表達可通過上調(diào)Snail蛋白表達促進肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Zhu等[21]研究證實，下調(diào)Snail蛋白和上調(diào)E-cad蛋白會抑制人胃癌SGC-7901細胞侵襲。本研究表明，TA可能通過下調(diào)LOXL2/Snail通路促進E-cad蛋白表達，這可能是TA抑制SGC-7901細胞侵襲的機制之一。

Hong等[17]研究證實，敲除LOXL2基因可抑制腎癌細胞中MMP9蛋白表達。MMP9屬基質(zhì)金屬蛋白酶超家族成員，可高效降解Ⅳ型膠原蛋白。Ⅳ型膠原蛋白是構(gòu)成細胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，而細胞外基質(zhì)和基底膜是防御惡性腫瘤細胞向周圍組織侵襲的天然屏障。惡性腫瘤細胞可通過分泌MMP9破壞細胞外基質(zhì)和基底膜的完整性，侵犯周圍組織、進而侵入血管和淋巴管向遠處轉(zhuǎn)移。Wei等[22]研究顯示，上調(diào)MMP9蛋白表達可增強SGC-7901細胞的侵襲能力。本研究表明，TA可劑量依賴性地抑制MMP9蛋白表達，這可能與TA下調(diào)LOXL2表達有關(guān)。

綜上所述，TA可在體外抑制人胃癌SGC-7901細胞侵襲，這可能與其抑制SP1和LOXL2表達，進而下調(diào)Snail和MMP9蛋白水平，上調(diào)E-cad蛋白水平有關(guān)。本研究為豐富TA的抗腫瘤侵襲作用提供新的實驗依據(jù)。