楊靖亞 方 艷 陸曉帆 張 建 趙 勇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

副溶血弧菌是革蘭氏陰性嗜鹽菌，存在于沿海棲息地和河口,是導(dǎo)致日本海產(chǎn)品相關(guān)胃腸炎的主要原因[1,2]。副溶血弧菌是人類病原體，可引起胃腸炎、傷口感染和敗血癥[3]。毒性副溶血弧菌菌株通常產(chǎn)生熱穩(wěn)定的直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)和/或TDH相關(guān)溶血素(TRH)，被認(rèn)為是物種致病性分子標(biāo)記[4-7]。TDH可引起Wagatsuma瓊脂培養(yǎng)基中稱為神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon，KP)的β型溶血，大部分臨床分離株均為KP陽性[8，9]。

現(xiàn)已開發(fā)了副溶血弧菌的多重PCR檢測(cè)方法，同時(shí)使用物種特異性基因和毒素基因用于毒性特異性檢測(cè)和非毒性副溶血菌株檢測(cè)，但靈敏度和特異性不高，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果[10-14]。因此相繼開發(fā)了針對(duì)TDH的新型檢測(cè)方法，如質(zhì)譜-脈沖電泳-PCR連用技術(shù)、斑點(diǎn)ELISA方法、CPA-核酸試紙條法，但具有耗時(shí)、成本昂貴等缺陷[15-17]。目前急需一種便捷、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)方法以滿足市場(chǎng)需求。向輝等[18]研發(fā)了新型納米標(biāo)記免疫層析技術(shù)，但待測(cè)樣本的前處理較為繁瑣。

膠體金試紙條檢測(cè)法是一項(xiàng)發(fā)展迅速的新型檢測(cè)手段，使用便捷、檢測(cè)速度、靈敏度高、特異性強(qiáng)，但目前國內(nèi)對(duì)于將膠體金技術(shù)用于副溶血弧菌TDH的快速檢測(cè)鮮有報(bào)道[19]。本研究旨在研制針對(duì)副溶血弧菌TDH快速檢測(cè)的快速免疫膠體金檢測(cè)板，以滿足大批量樣品快速高效檢測(cè)的需要。

1 材料與方法

1.1材料 副溶血弧菌(ATCC33846)、沙門氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(上海海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))，抗TDH單克隆抗體T6D4、T9H4和毒素TDH(本實(shí)驗(yàn)室純化制備)，氯金酸(HAuCl4，Sigma公司)，牛血清蛋白、Tween 20 (上海正極生物有限公司)，Tris、sucrose (上海生工生物有限公司)，Whatman AE99、Pall Vivid 170、Sartorius CN140、Millipore 135 硝酸纖維素膜(上海杰一生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1制備膠體金溶液 參考文獻(xiàn)[20]，將待用玻璃器皿洗凈、浸泡于5%二氯二甲基硅烷的氯仿溶液中，超純水沖凈干燥。100 ml 0.01% HAuCl4置于恒溫磁力攪拌器煮沸，迅速加入1.2 ml新鮮配制的1% 檸檬酸三鈉持續(xù)加熱，不斷攪拌至液體顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色并繼續(xù)煮沸10 min。待膠體金溶液冷卻至室溫后補(bǔ)充超純水至100 ml，收集于棕色玻璃瓶并置于4℃冰箱中備用。

1.2.2膠體金-抗體復(fù)合溶液制備 磁力攪拌器室溫勻速攪拌60 min，使膠體金溶液中的金顆粒與待標(biāo)記TDH單克隆抗體T6D4充分吸附平衡，加入10% BSA 0.01 mol/L PBS(pH7.4)，封閉處理金顆粒上未結(jié)合單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)，使復(fù)合物溶液中BSA終濃度為1%，室溫勻速繼續(xù)攪拌60 min，13 000 r/min 離心60 min，去上清，加入2 ml 0.01 mol/L PBS(pH7.4)保存液重懸沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3膠體金顆粒與待標(biāo)記抗體的標(biāo)記試驗(yàn) 選擇單克隆抗體T6D4作為捕獲抗體與膠體金顆粒標(biāo)記，制備膠體金-抗體的復(fù)合物溶液。加入0.1 mol/L K2CO3調(diào)整膠體金溶液pH值，設(shè)置pH為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每試管膠體金溶液中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 μl 1 mg/ml的待標(biāo)記單克隆抗體T6D4，充分混勻后室溫靜置30 min，每管添加100 μl 10% NaCl溶液觀察溶液顏色，進(jìn)行pH和抗體標(biāo)記量優(yōu)化。

1.2.4金標(biāo)溶液最佳釋放條件的優(yōu)化 設(shè)置不同蔗糖濃度的金標(biāo)溶液稀釋液和不同濃度Tween 20樣品墊預(yù)處理液。分別為1%、3%、5%蔗糖的1%BSA 0.01 mol/L PBS(pH7.4)；含0.5%、1%、2%Tween 20的0.01 mol/L PBS(pH7.4)。

1.2.5假陽性消減試驗(yàn) 選用2 mg/ml濃度羊抗小鼠的抗體包被試紙條上的C線作為質(zhì)控線；選用2 mg/ml的T9H4單抗包被試紙條上的T線，作為檢測(cè)線；選用含5% sucrose的1% BSA 0.01 mol/L PBS(pH7.4)溶液以1∶1含稀釋金標(biāo)抗體溶液包被金標(biāo)墊。為防止假陽性結(jié)果，在洗滌液中加入一定量鹽離子，分別設(shè)置含0.1%、0.2%、0.3%、0.4% NaCl的1% Tween 20 0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗滌液，檢測(cè)空白樣本，得到最佳鹽離子濃度，進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)體系。

1.2.6NC膜上檢測(cè)抗體T9H4的稀釋緩沖液及檢測(cè)濃度的優(yōu)化 稀釋溶液的pH值會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的顯色造成影響，分別選用pH7.0、7.4、8.0的3種0.01 mol/L PBS溶解檢測(cè)抗體T9H4，點(diǎn)于NC膜上。選定最佳檢測(cè)抗體溶解液后，分別設(shè)置0.5、1.0、1.5 mg/ml濃度的檢測(cè)抗體T9H4，點(diǎn)于T線，以期尋找出最佳檢測(cè)濃度。

1.2.7不同型號(hào)NC膜的比較 選擇Whatman AE99、Pall Vivid 170、Sartorius CN140、Millipore 135硝酸纖維素膜4種硝酸纖維素膜進(jìn)行組裝，檢測(cè)結(jié)果。

1.2.8快速免疫膠體金檢測(cè)板的組裝及使用 試紙條PVC底板用切條機(jī)裁剪為8.0 cm×0.5 cm，依次將NC膜、吸水墊、金標(biāo)結(jié)合墊、樣品墊黏附于PVC膠板；其中金標(biāo)結(jié)合墊為單克隆抗體T6H4標(biāo)記的膠體金溶液，NC膜的檢測(cè)線為單克隆抗體T9H4、質(zhì)控線C線上采用羊抗小鼠抗體，37℃恒溫條件下干燥60 min后組裝。

1.2.9快速免疫膠體金檢測(cè)板的靈敏度檢測(cè) 在最佳檢測(cè)體系下分別檢測(cè)不同稀釋度的TDH，分析所制備的快速免疫膠體金檢測(cè)板的最低檢測(cè)限。

1.2.10快速免疫膠體金檢測(cè)板的特異性檢測(cè) 37℃、180 r/min下，對(duì)副溶血弧菌(含TDH)、沙門氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株進(jìn)行液體增菌搖床培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清作為陰性檢測(cè)樣本和TDH陽性樣本(2 μg/ml)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，確定所制備的快速免疫膠體金檢測(cè)板對(duì)TDH檢測(cè)的特異性。

2 結(jié)果

2.1膠體金溶液質(zhì)量分析 檸檬酸三鈉還原法制備溶液，紫外可見分光光度法測(cè)定400～700 nm處膠體金溶液吸光度，在527 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，對(duì)應(yīng)金顆粒大小約為40 nm，吸收曲線平滑、峰值單一、峰谷較窄，由此推斷所制備的40 nm金顆粒大小的膠體金溶液不含雜質(zhì)，顆粒大小均勻，見圖1。

圖1 納米膠體金顆粒的全波長掃描Fig.1 Full wavelength scaning for nanogold

2.2抗體與金顆粒的標(biāo)記結(jié)果 pH=8.0時(shí)，抗體T6D4可與40 nm大小的金顆粒穩(wěn)定結(jié)合，即在加入10%NaCl后，溶液平衡不受外界離子破壞，溶液仍保持酒紅色，2 μg/ml的金溶液呈抗體最佳結(jié)合量，見圖2。

圖2 最佳抗體標(biāo)記量分析Fig.2 Analysis of optimal antibody labeling quantity

2.3金標(biāo)溶液最佳釋放條件 8號(hào)試紙條的金標(biāo)墊完全呈白色，表明金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體溶液具有高復(fù)溶性及強(qiáng)釋放率，因此選定樣品墊采用含2%Tween 20的0.01 mol/L PBS(pH7.4)處理，金標(biāo)墊用含3% sucrose 1% BSA 0.01 mol/L PBS(pH7.4)處理，作為初始溶液體系用于后續(xù)研究，見圖3。

圖3 金標(biāo)溶液的最佳釋放條件Fig.3 Best condition on release of gold-labled solutionNote:1.1% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 0.5% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；2.3% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 0.5% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；3.5% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 0.5% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；4.1% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 1% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；5.3% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 1% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；6.5% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 1% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；7.1% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 2% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；8.3% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 2% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad)；9.5% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS (gold-labled pad) and 2% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS (sample pad).

2.4假陽性消減試驗(yàn)分析 NaCl含量為0.1%～0.4%時(shí)假陽性結(jié)果的消減呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.5NC膜上檢測(cè)抗體T9H4的稀釋緩沖液及最適檢測(cè)濃度的確定 以1 μg/ml的TDH陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)選用pH7.4時(shí)的0.01 mol/L PBS作為T9H4的包被溶液時(shí)，顯色性較好。在選定最佳檢測(cè)抗體包被液后，以1 μg/ml的TDH陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)包被濃度達(dá)到1 mg/ml后，結(jié)果顯色性基本保持不變，均呈現(xiàn)良好的陽性結(jié)果，因此最終選定最佳T線抗體包被濃度為1 mg/ml，見圖4。

圖4 快速免疫膠體金檢測(cè)板最低檢測(cè)限分析Fig.4 Analysis of minimum detection limit of immunochromatographic test strips

2.6NC膜型號(hào)的選擇 對(duì)于同樣檢測(cè)500 ng/ml的TDH陽性樣本，4款膜的陽性結(jié)果顯色效果中，Sartorius CN140表現(xiàn)最佳且檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，雖然Sartorius CN140的跑水速度較慢，但金標(biāo)抗體溶液在膜上的跑動(dòng)效果最好。因此，選定Sartorius CN140硝酸纖維素膜作為本次實(shí)驗(yàn)的膠體金檢測(cè)板，見圖5。

圖5 快速免疫膠體金檢測(cè)板的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of immunochromatographic test stripNote:A.E.coli;B.Salmonella;C.Listeria monocytogenes;D.F188;E.ATCC33846(TDH).

3 討論

研究表明TDH具有呈劑量和時(shí)間依賴性的肝毒性和非常迅速的致死效應(yīng)[21,22]。快速便捷地進(jìn)行TDH檢測(cè)對(duì)于預(yù)防和監(jiān)控TDH相關(guān)疾病具有重要意義。傳統(tǒng)TDH檢測(cè)技術(shù)包括常規(guī)分離培養(yǎng)、電化學(xué)法等，但檢測(cè)時(shí)間較長、特異性較差。PCR檢測(cè)需要昂貴的檢測(cè)儀器以及專業(yè)的操作人員。隨著檢測(cè)方法的不斷深入，近年來更多的學(xué)者傾向于利用免疫效應(yīng)開發(fā)新型檢測(cè)手段[23,24]。

本實(shí)驗(yàn)利用2株TDH單克隆抗體成功地制備了能夠特異性檢測(cè)副溶血弧菌TDH的快速免疫膠體金檢測(cè)板，樣品墊采用2% Tween 20 0.01 mol/L pH7.4 PBS處理、金標(biāo)墊采用3% sucrose 1%BSA 0.01 mol/L pH7.4 PBS處理，所得金標(biāo)抗體溶液復(fù)溶性高，釋放率強(qiáng)。選用pH7.4時(shí)的0.01 mol/L PBS作為T9H4的包被溶液時(shí)，顯色性較好，確定最佳T線抗體包被濃度為1 mg/ml。人工組裝的快速免疫膠體金檢測(cè)板檢測(cè)限為500 ng/ml，且具有較強(qiáng)特異性。

目前國內(nèi)對(duì)于將膠體金技術(shù)用于副溶血弧菌TDH的快速檢測(cè)鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)所得的快速免疫膠體金檢測(cè)板顯著降低了樣品的前處理要求，可在5 min 內(nèi)完成檢測(cè)，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，本研究為副溶血弧菌TDH的現(xiàn)場(chǎng)、快速、簡單、無需設(shè)備的檢測(cè)提供了新的手段。