阮 鵬 譚愛麗

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科,武漢 430060)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種和病死原因，70%的患者被確診時(shí)已是晚期[1,2]。隨著我國(guó)人口老齡化不斷加快，NPC的發(fā)病率與死亡率可能還將不斷上升，由此帶來的癌癥負(fù)擔(dān)也將持續(xù)增長(zhǎng)[1,3]。目前，NPC的治療仍以放化療為主，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因[4]。腫瘤免疫已成為近年腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，越來越多的研究表明免疫治療在腫瘤中有著廣闊前景[5,6]。腫瘤的免疫治療利用腫瘤的免疫學(xué)特性改變機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答水平，進(jìn)而殺傷與抑制腫瘤[7]。研究證實(shí)，多種細(xì)胞因子在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，已被用于腫瘤的免疫治療[8]。

趨化因子是指能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞因子，不僅參與了免疫反應(yīng)，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[9]。CXC趨化因子配體-5(CXC chemokine ligand-5，CXCL5)是CXC趨化因子的家族成員[10]。CXCL5可通過與其特異性受體CXCR2結(jié)合介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[11]。報(bào)道指出，CXCL5在多種腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織[12-15]。而針對(duì)CXCL5在NPC中的作用尚無報(bào)道，本次研究的目的是探討CXCL5在NPC中的作用及其潛在的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 本次研究共納入2017年6月～2019年2月我院收治的98例NPC患者作為研究對(duì)象；其中男性59例，女性39例；年齡26～63歲，平均年齡(43.7±12.4)歲。參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)頭頸外科學(xué)分會(huì)制定的NPC診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患者進(jìn)行診斷，所有患者均經(jīng)病理活檢或術(shù)后病理學(xué)確診，均未進(jìn)行過任何治療。所有患者的TNM分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期24例、Ⅲ期41例、Ⅳ期24例；病理學(xué)分型：Ⅰ型5例、Ⅱ型11例、Ⅲ型82例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期或長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫藥物的患者；②有放化療史的患者；③復(fù)發(fā)性NPC患者；④并發(fā)其他腫瘤患者；⑤臨床資料不全的患者；⑥伴有嚴(yán)重心肝腎功能障礙的患者；⑦伴有全身感染性疾病的患者；⑧長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良患者；⑨妊娠期或哺乳期女性。另選取38例同期在我院進(jìn)行體檢的健康志愿者作為對(duì)照，其中男性24例，女性14例；年齡29～67歲，平均年齡(46.1±17.3)歲。兩組患者的性別、年齡相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 人CXCL5 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems)；重組人CXCL5蛋白(武漢艾美捷科技有限公司)；CXCL5抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、MAPK抗體、p-NF-κB抗體、NF-κB抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；p-PI3K抗體、PI3K抗體、β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)；ERK/MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑SCH772984(美國(guó)Selleckchem公司)；流式抗體包括：APC標(biāo)記的CD4抗體、FITC標(biāo)記的CD8抗體、PE標(biāo)記的CD16抗體、FITC標(biāo)記的CD56抗體(美國(guó)BioLegend公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BALB/c小鼠及CNE-2細(xì)胞購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3主要設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀、Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1ELISA 抽取NPC患者和健康志愿者清晨空腹靜脈血10 ml，置于促凝管中，自然凝固后將樣品1 000 g離心20 min之后進(jìn)行直接檢測(cè)或于-80℃儲(chǔ)存待檢。按照產(chǎn)品說明書，使用CXCL5 ELISA試劑盒檢測(cè)患者的血清CXCL5水平，采用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量。

1.2.2細(xì)胞處理 構(gòu)建pLenti-CMV-CXCL5過表達(dá)質(zhì)粒，采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，慢病毒感染CNE-2細(xì)胞后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)CXCL5的CNE-2細(xì)胞。用Western blot檢測(cè)對(duì)照與穩(wěn)定表達(dá)CXCL5的CNE-2細(xì)胞中PI3K/AKT、ERK/MAPK及NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)水平。

1.2.3Western blot 研磨NPC患者腫瘤及癌旁正常組織或小鼠腫瘤組織，采用RIPA裂解液(含cocktail蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解提取總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣80～120 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%BSA封閉后，分別加入CXCL5抗體、p-AKT抗體、p-ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、p-PI3K抗體、p-NF-κB抗體(1∶1 000)；AKT抗體、ERK1/2抗體、MAPK抗體、PI3K抗體、NF-κB抗體(1∶2 000)；β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜，經(jīng)洗滌，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，DBA顯色。

1.2.4免疫組化染色 每例患者和健康志愿者各取1塊活檢標(biāo)本并用10%甲醛溶液固定過夜后石蠟包埋。采用SP法檢測(cè)組織CXCL5、CXCR2或p-ERK1/2的水平。將所有石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次。用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min，滴加CXCL5或p-ERK1/2一抗工作液，4℃過夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。計(jì)算陽性染色的平均光密度。

1.2.5小鼠模型的建立 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的對(duì)照與穩(wěn)定表達(dá)CXCL5的CNE-2鼻咽癌細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，無菌條件下接種于小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下，0.1 ml/只。接種后每隔1 d觀察一次小鼠，連續(xù)觀察60 d，觀察時(shí)記錄小鼠的腫瘤大小和死亡情況。繪制小鼠的腫瘤生長(zhǎng)與生存曲線。IHC與Western blot分析各組小鼠腫瘤組織中CXCL5與p-ERK1/2的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取新鮮小鼠鼻咽癌腫瘤組織，RPMI1640培養(yǎng)基中消化過夜后進(jìn)行研磨，經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入離心管，根據(jù)說明書加入適當(dāng)比例的待測(cè)抗體(CD4、CD8、CD56或CD16)，混勻后室溫避光孵育30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加PBS洗5 min×3次，棄上清。加0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，混勻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7NK細(xì)胞活性檢測(cè) 根據(jù)產(chǎn)品說明書分離BALB/c小鼠的PBMC。將分離的PBMC進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別用重組CXCL5與ERK/MAPK抑制劑SCH77298處理。計(jì)數(shù)細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔鋪于96孔板中。將CNE-2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞=50∶1加入靶細(xì)胞，并設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照，每孔總液量200 μl，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去100 μl上清，加入15 μl MTT再孵育4 h，每孔加100 μl MTT溶解液培養(yǎng)箱孵育8 h，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm OD值(參考波長(zhǎng)630 nm)。根據(jù)以下公式計(jì)算：NK細(xì)胞活性=[靶細(xì)胞對(duì)照孔OD-(反應(yīng)孔OD-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD)]/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD。

2 結(jié)果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入123例NPC患者，其中7例近期或長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫藥物；5例有放化療史；5例為復(fù)發(fā)性鼻咽癌；2例并發(fā)其他腫瘤；2例臨床資料不全；1例伴有嚴(yán)重心肝腎功能障礙；1例伴有全身感染性疾病；1例長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良；1例妊娠期女性。

2.2NPC患者血清及組織CXCL5水平分析 ELISA結(jié)果顯示，NPC患者的血清CXCL5水平顯著高于健康志愿者[(247.9±23.6)ng/L vs(144.8±14.7)ng/L,P<0.05]。IHC與Western blot結(jié)果顯示，NPC患者腫瘤組織中CXCL5與CXCR2的水平均顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 NPC患者血清及癌組織CXCL5水平Fig.1 Expression of CXCL5 in serum and tumor tissue of NPC patientsNote:A.ELISA analysis;B.IHC staining result (×20);C.Western blot of 8 NPC patients.***.P<0.001 vs Healthy Normal.

2.3腫瘤CXCL5水平與臨床特征的關(guān)系 根據(jù)患者腫瘤組織中CXCL5的表達(dá)水平，以所有患者的平均光密度值為界限將所有患者分為CXCL5低表達(dá)組(CXCL5Low)與CXCL5高表達(dá)組(CXCL5High)。CXCL5低表達(dá)組55例，CXCL5高表達(dá)組43例。NPC患者中CXCL5高表達(dá)與CXCL5低表達(dá)組的年齡、性別、原發(fā)腫瘤范圍與病理學(xué)分型相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CXCL5高表達(dá)組患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率均顯著高于CXCL5低表達(dá)組(P<0.05)，見表1。

表1 腫瘤組織CXCL5與臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relation between level of CXCL5 in tumor tissues and clinical characteristics

2.4CXCL5對(duì)NPC細(xì)胞信號(hào)通路的影響 Western blot顯示CXCL5過表達(dá)與重組CXCL5蛋白(rCXCL5)處理能顯著提高CNE-2細(xì)胞p-ERK1/2與p-MAPK的表達(dá)水平，而不影響p-PI3K、p-AKT與p-NF-κB的表達(dá)提高，見圖2。

圖2 CXCL5對(duì)NPC細(xì)胞信號(hào)通路的影響Fig.2 Effect of CXCL5 on signal pathways of NPC cellsNote:A.Effect of CXCL5 overexpression on PI3K/AKT,ERK/MAPK and NF-κB signals of CNE-2 cells；B.Effect of rCXCL5 (100 ng/ml) on PI3K/AKT,ERK/MAPK and NF-κB signals of CNE-2 cells.

2.5小鼠模型的建立與分析 CXCL5過表達(dá)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線與生存曲線與對(duì)照組小鼠具有顯著差異(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)CXCL5組小鼠腫瘤組織CXCL5與p-ERK1/2的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組小鼠。流式分析顯示過表達(dá)CXCL5組小鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組小鼠(P<0.05)，見圖3。

圖3 小鼠模型分析Fig.3 Mice model analysisNote:A.Photographic illustration of tumors from mice;B.Tumor growth curve of mice;C.Survival curve of mice;D.Expression level of CXCL5 and p-ERK1/2 in mice tumor tissue;E.Flow cytometry analysis of CD4+ T and CD8+ T cells in mice tumor tissue;F.Flow cytometry analysis of CD56+CD16+ NK cells in mice tumor tissue.***.P<0.001 vs vector.

2.6CXCL5對(duì)NK細(xì)胞活性的影響 分離正常BALB/c小鼠PBMC，分別用rCXCL5與SCH772984處理。rCXCL5能顯著降低PBMC中NK細(xì)胞的活性，而不影響ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑SCH772984預(yù)處理的PBMC中NK細(xì)胞的活性(P>0.05)，見圖4。

圖4 rCXCL5對(duì)PBMC中NK細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effect of rCXCL5 on activity of NK cells in PBMCNote:***.P<0.001 vs Normal.

3 討論

NPC的浸潤(rùn)性高、侵襲性強(qiáng)，臨床上以放射治療為主要治療策略[1,4]。近年來，隨著放療技術(shù)的進(jìn)步與綜合治療的進(jìn)展，NPC的療效有所提高[2,4]。早期NPC患者的療效尚可，5年生存率可達(dá)80%以上[2]。然而，由于鼻腔位置隱蔽，且臨床癥狀表現(xiàn)多樣，約75%的患者確診時(shí)已是中晚期，其5年生存率不到50%[2,4]。針對(duì)這類患者，臨床多采用放療、化療與分子靶向相結(jié)合的綜合治療策略[4]。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多基因與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、局部淋巴轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[2]。分子靶向治療，如靶向表皮生長(zhǎng)因子受體、血管生成抑制劑與環(huán)氧化酶(COX)-2抑制劑的治療已逐步應(yīng)用于臨床并取得一定的進(jìn)展[2,4]。而NPC的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明。因此，進(jìn)一步探討NPC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。本研究旨在探討趨化因子CXCL5通過抑制腫瘤免疫促進(jìn)NPC的作用，并研究其潛在的分子機(jī)制。

CXCL5又名上皮來源的中性粒細(xì)胞活化肽78(ENA-78)，可通過ELR功能區(qū)與其特異性受體CXCR2結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)血管新生，介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[12,16]。近年來，CXCL5在腫瘤中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。研究指出，CXCL5在肝癌、胃癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織中的表達(dá)顯著升高，CXCL5可促進(jìn)胃癌與非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移[12-15]。而針對(duì)CXCL5在鼻咽癌中的作用尚無人報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，NPC患者的血清與腫瘤組織中的CXCL5水平均出現(xiàn)顯著升高，且過表達(dá)CXCL5組小鼠的生存曲線和移植瘤生長(zhǎng)曲線均顯著差于對(duì)照組小鼠，提示CXCL5及其受體CXCR2可能參與了鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。

研究指出，鼻咽癌腫瘤組織中的p-ERK1/2水平顯著高于正常組織，ERK/MAPK信號(hào)通路的持續(xù)激活可能參與了NPC的發(fā)生與發(fā)展過程[17,18]。本研究顯示，重組CXCL5蛋白能顯著增加CNE-2細(xì)胞p-ERK1/2與p-MAPK的表達(dá)水平，而不影響p-PI3K、p-AKT與p-NF-κB的表達(dá)水平，提示CXCL5可能通過ERK/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮促NPC的作用。

近年來，免疫治療已經(jīng)成為腫瘤學(xué)的一個(gè)熱門研究方向[5]。目前免疫治療已在黑色素瘤、淋巴瘤等的治療中取得良好療效[6]。針對(duì)NPC的免疫治療主要有腫瘤疫苗、免疫節(jié)點(diǎn)抑制劑及過繼性免疫治療等[19]。本研究顯示，過表達(dá)CXCL5組小鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組小鼠。且重組CXCL5處理能顯著降低小鼠PBMC中NK細(xì)胞的活性，而不影響ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑SCH772984預(yù)處理的PBMC中NK細(xì)胞的活性。因此，CXCL5可能通過ERK/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抑制NPC腫瘤免疫的作用。

綜上所述，NPC患者血清及腫瘤組織中CXCL5表達(dá)水平均顯著增高，CXCL5可能通過調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)鼻咽癌的作用。