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乳酸鏈球菌素與乳酸對(duì)維氏氣單胞菌的協(xié)同抑制和損傷作用

2020-12-17 01:26王洋王競(jìng)?cè)?/span>羅云龍白東清季延濱余政豪淡清華于波
關(guān)鍵詞:菌體革蘭氏單胞菌

王洋,王競(jìng)?cè)澹_云龍,白東清,季延濱,余政豪,淡清華,于波

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300384)

水產(chǎn)動(dòng)物免疫水平低,易患細(xì)菌性疾病,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的生產(chǎn)損失。目前,水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中為提高水產(chǎn)動(dòng)物抗病力、降低死亡率最常采取的有效方式之一就是施用抗生素或一些化學(xué)合成藥物。然而,化學(xué)藥物安全性低,易產(chǎn)生藥物殘留,殺菌效果不理想,而抗生素的濫用又會(huì)造成細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生,故這些抗生素或化學(xué)藥物現(xiàn)已被逐漸淘汰和限制使用,因此,尋求良好的抗生素替代品是水產(chǎn)養(yǎng)殖界最為關(guān)心的課題之一[1]。目前,抗菌肽作為新型抑菌物質(zhì),其功能、性質(zhì),及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用前景均引起了人們的關(guān)注[2]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)廣泛分布于人、畜、禽、水產(chǎn)等動(dòng)物體內(nèi),研究發(fā)現(xiàn),部分菌株可以作為水產(chǎn)益生菌,提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病性能[3-4]。其作用機(jī)理包括:直接分泌抗菌物質(zhì)、拮抗病原菌[5];刺激宿主免疫,增強(qiáng)宿主免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性,提高機(jī)體免疫水平[6-7]等。乳酸菌的抗菌代謝產(chǎn)物主要包括有機(jī)酸[8]、細(xì)菌素[9]和過(guò)氧化氫[10]等。L(+)-乳酸是一種乳酸菌利用糖類(lèi)所產(chǎn)生的基本代謝產(chǎn)物,具有良好抑菌殺菌作用[11],易被人體代謝[12],美國(guó)食品藥品管理局認(rèn)定其為一般公認(rèn)的安全食品添加劑(GRAS)。乳酸菌細(xì)菌素是部分乳酸菌產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有顯著抑殺作用的肽類(lèi)(少數(shù)乳酸菌細(xì)菌素可抑制革蘭氏陰性菌)[13]。Verschuere等[14]指出,細(xì)菌素有望成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的替代品。

水產(chǎn)動(dòng)物的致病微生物多為革蘭氏陰性菌,如嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、維氏氣單胞菌Aeromonasveronii、愛(ài)德華氏菌Edwardsiellatarda、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus、鰻魚(yú)弧菌Vibrioanguillarm、溫和氣單胞菌Aeromonassobria、殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida、熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens、水型點(diǎn)狀假單胞菌Pseudomonaspunctata和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌Aeromonaspunctata等。革蘭氏陰性病原菌通常對(duì)有機(jī)酸敏感,但對(duì)低濃度酸具有一定耐受性[15]。由于水產(chǎn)動(dòng)物腸道較短,且微生物數(shù)量較少,因此,益生乳酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)產(chǎn)生的乳酸濃度未必足以殺死全部致病菌。因此,產(chǎn)酸特征不足以保證乳酸菌提高宿主抗細(xì)菌病的能力。實(shí)際應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn),各類(lèi)乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果具有明顯的菌株特異性[16]。本團(tuán)隊(duì)前期研究證明,在產(chǎn)酸能力相當(dāng)時(shí),產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌對(duì)革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的控制力[17]。Nyk?nen等[18]研究發(fā)現(xiàn),乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵物與乳酸對(duì)魚(yú)源熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens及銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa有協(xié)同抑制。因此,本研究中提出假設(shè):乳酸菌的兩類(lèi)抑菌產(chǎn)物,細(xì)菌素與乳酸具有協(xié)同抑制革蘭氏陰性菌的作用。為證明這一假設(shè),本研究中選用目前商業(yè)化的乳酸鏈球菌素(nisin),研究其與低濃度乳酸對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要危害菌——維氏氣單胞菌的抑殺作用與機(jī)理,并提出了乳酸菌提高水產(chǎn)動(dòng)物抗病性的一種新機(jī)理,旨在為篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌作為水產(chǎn)益生菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

維氏氣單胞菌分離自患腸炎病的錦鯉Cyprinuscarpio。

試劑:L-乳酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)乳酸,記為la),純度>90%(西隴化工股份有限公司);食品級(jí)nisin(天津艾瑪斯特生物科技有限公司),推薦使用量為0.03~0.20 g/kg;LB培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。

儀器:全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific,美國(guó));全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析儀Bioscreen C(Bioscreen Company,芬蘭);環(huán)境掃描電子顯微鏡Quanta 200FEG(FEI Company,荷蘭)。

1.2 方法

1.2.1 nisin與乳酸對(duì)指示菌的生長(zhǎng)抑制

1)比濁法測(cè)定生長(zhǎng)抑制效果。將活化好的維氏氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基,配制成活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液,試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、4 mmol/L 乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L 乳酸+nisin(0.01、0.05 g/L)處理組。每組樣品取100 μL,加入96孔板中,于30 ℃下培養(yǎng)12 h,以酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm值。

2)生長(zhǎng)曲線(xiàn)及生長(zhǎng)參數(shù)。將活化好的維氏氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基,配制成活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液,分別制成對(duì)照組、4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L乳酸+nisin(0.01、0.05 g/L)處理組。每組樣品取200 μL,加入生長(zhǎng)曲線(xiàn)儀專(zhuān)用培養(yǎng)板中,采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析儀,于30 ℃下連續(xù)培養(yǎng)至48 h,期間每間隔30 min測(cè)定一次OD600 nm值,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),以修正的Gomptz模型擬合[19],計(jì)算生長(zhǎng)延滯期(lag time)、比生長(zhǎng)速率(μmax)、平臺(tái)期最大活菌數(shù)(OD600 nm max)等生長(zhǎng)參數(shù)。

1.2.2 nisin與乳酸對(duì)指示菌的致死作用 將活化好的維氏氣單胞菌重懸于生理鹽水溶液中,配制成活菌數(shù)為1×105CFU/mL,在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液,制成對(duì)照組、4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L 乳酸+0.05 g/L nisin處理組。定時(shí)取樣以平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.2.3 菌株運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)培養(yǎng)基為0.5% NaCl、1%胰蛋白胨、0.25%瓊脂,于121 ℃下滅菌15 min后制備平板。平板上分別加入 1 μL 經(jīng)未處理、 4 mmol/L 乳酸處理、0.05 g/L nisin處理、4 mmol/L乳酸+0.05 g/L nisin處理8 h的維氏氣單胞菌,30 ℃下培養(yǎng)24 h,觀察菌落直徑[20]。

1.2.4 生物被膜檢測(cè) 用無(wú)菌生理鹽水洗滌對(duì)數(shù)末期的維氏氣單胞菌3次,用LB 重懸至 1×108CFU/mL。試驗(yàn)設(shè)置4組,分別為對(duì)照組(蒸餾水)、 4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L乳酸+ nisin (0.005 g/L、0.01 g/L、0.05 g/L )處理組。于 30 ℃下培養(yǎng)36 h 后,孔內(nèi)加滿(mǎn)結(jié)晶紫試劑[21]染色30 min后,結(jié)晶紫附著于生物被膜,棄去多余的結(jié)晶紫后,用等體積無(wú)水乙醇將附著于生物被膜的結(jié)晶紫洗脫,測(cè)定OD595 nm值(結(jié)晶紫的吸光值,吸光值大小反映體系中結(jié)晶紫的濃度高低,結(jié)晶紫濃度的高低反映生物被膜量的多寡)。

在加入爬片的24孔聚苯乙烯孔板中,分別設(shè)置對(duì)照組(400 μL菌液+100 μL生理鹽水)、 400 μL菌液+50 μL 4 mmol/L乳酸+50 μL 生理鹽水、400 μL菌液+50 μL 0.05 g/L nisin+50 μL 生理鹽水、400 μL菌液+50 μL 0.05 g/L nisin+50 μL 4 mmol/L乳酸共4組,于30 ℃下培養(yǎng)72 h后,以無(wú)菌HEPES緩沖液清洗去除懸浮菌體。結(jié)晶紫染色1.0~1.5 min后,置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 質(zhì)子動(dòng)勢(shì)和膜電動(dòng)勢(shì) 維氏氣單胞菌(106~107CFU/mL)懸于HEPES緩沖液,以葡萄糖能量化[22]。

1)nisin對(duì)膜電動(dòng)勢(shì)(ΔΨ)消散作用的測(cè)定。加入1 μmol/L尼日利亞菌素來(lái)處理菌體以消除跨膜pH梯度差(ΔpH),之后加入電動(dòng)勢(shì)熒光探針DisC3(5)孵育,分別設(shè)置空白對(duì)照組(蒸餾水)、4 mmol/L乳酸處理組、 0.05 g/L nisin處理組、 4 mmol/L乳酸+ 0.05 g/L nisin處理組,并以多功能酶標(biāo)儀連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化[23]。

2) nisin對(duì)ΔpH影響的測(cè)定。向能量化菌懸液中加入1 μmol/L纈氨霉素以徹底消除ΔΨ,并加入熒光染料BCECF-AM(終濃度為3 μmol/L)孵育。4個(gè)組別設(shè)置同上,使用多功能酶標(biāo)儀連續(xù)記錄熒光強(qiáng)度[24]。

1.2.6 掃描電鏡 收集對(duì)數(shù)末期維氏氣單胞菌,以生理鹽水溶液重懸,4個(gè)組別設(shè)置同“1.2.5節(jié)”,處理12 h后取樣,固定處理樣品[25],利用環(huán)境掃描電子顯微鏡來(lái)采集細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析,用Duncan法進(jìn)行多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。利用Excel軟件計(jì)算各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 nisin和乳酸對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用

從圖1A可見(jiàn):對(duì)照組維氏氣單胞菌的OD600 nm值為1.37,nisin單獨(dú)處理組為1.31,與對(duì)照組相比,單獨(dú)添加nisin未影響OD600 nm值(P>0.05);乳酸處理組OD600 nm(0.90)顯著降低(P<0.05);在加入乳酸的基礎(chǔ)上添加 0.01 g/L nisin,維氏氣單胞菌的OD600 nm值顯著下降至0.38,且隨著nisin質(zhì)量濃度的升高,下降幅度更大,當(dāng)nisin質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 g/L 時(shí),OD600 nm顯著低于所有處理組(P<0.05)。

從圖1B可見(jiàn):在培養(yǎng)的48 h內(nèi),對(duì)照組菌體快速增長(zhǎng),OD600 nm值迅速升高,很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期,nisin單獨(dú)處理組的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組類(lèi)似;乳酸的存在明顯干擾了菌體的生長(zhǎng),且在乳酸基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加nisin對(duì)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出顯著地抑制,并且抑制程度隨著細(xì)菌素nisin質(zhì)量濃度的增加而提高。

從表1可見(jiàn):在乳酸和細(xì)菌素協(xié)同處理下,維氏氣單胞菌的延滯期延長(zhǎng),μmax值和OD600 nm max值有所下降,且隨著細(xì)菌素質(zhì)量濃度升高,各參數(shù)也顯著變化(P<0.05),證明nisin和乳酸對(duì)革蘭氏陰性病原菌有聯(lián)用抑制效果;在4 mmol/L乳酸處理下,0.05 g/L nisin的添加可將菌株延滯期從5.12 h延長(zhǎng)至23.51 h,OD600 nm max值由1.39降低至1.20,μmax值從對(duì)照的0.36降低至0.11。

表1 nisin及乳酸協(xié)同對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)主要參數(shù)的影響(乳酸濃度4 mmol/L)

2.2 nisin和乳酸對(duì)維氏氣單胞菌的協(xié)同致死作用

從圖2可見(jiàn):與對(duì)照組相比,在處理的36 h內(nèi),nisin單獨(dú)處理組對(duì)維氏氣單胞菌并無(wú)致死作用,4 mmol/L乳酸處理組可造成菌體死亡;4 mmol/L乳酸和0.05 g/L nisin協(xié)同處理組,與同濃度乳酸或nisin單獨(dú)處理組相比,活菌數(shù)量大大降低,致死效果最為明顯,菌體在36 h 后已被全部殺死,表明二者協(xié)同作用發(fā)揮的抑菌效果比單獨(dú)作用更顯著。

2.3 nisin與乳酸協(xié)同對(duì)維氏氣單胞菌運(yùn)動(dòng)性影響

從圖3可見(jiàn):僅nisin組菌落擴(kuò)散直徑與對(duì)照組相比,無(wú)顯著性差異(分別為18.24、17.63 mmol/L)(P>0.05);加入4 mmol/L 乳酸后的維氏氣單胞菌的擴(kuò)散直徑顯著減小至14.49 mmol/L(P<0.05),為對(duì)照組的79.44%,而nisin+乳酸處理組菌落的擴(kuò)散直徑為對(duì)照組的61.79%,這表明乳酸與nisin協(xié)同處理能夠顯著減弱維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)性,其中,病原微生物擴(kuò)散的直徑大,表現(xiàn)了菌體的運(yùn)動(dòng)性強(qiáng),反之即運(yùn)動(dòng)性弱。

2.4 nisin與乳酸協(xié)同對(duì)維氏氣單胞菌生物被膜形成能力的影響

不同濃度nisin和乳酸協(xié)同處理108CFU/mL的維氏氣單胞菌,在培養(yǎng)第36 h時(shí)取樣測(cè)定,其結(jié)果如圖4所示。從圖4A可見(jiàn):nisin處理組和乳酸單獨(dú)處理組的OD595 nm值與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),這表明單獨(dú)的nisin 或者乳酸處理無(wú)法減少維氏氣單胞菌生物被膜的生成;而乳酸+nisin的聯(lián)用處理組與對(duì)照組相比,其生物被膜的生成量明顯降低,且降低幅度隨nisin含量的增加而提高,其中,4 mmol/L乳酸+0.05 g/L nisin處理組被膜生成量?jī)H為對(duì)照組的27.43%。圖4B直接顯示了乳酸和nisin對(duì)維氏氣單胞菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響,乳酸和nisin協(xié)同處理顯著降低了爬片上維氏氣單胞菌的數(shù)量,說(shuō)明協(xié)同處理抑制了菌體黏附。

2.5 nisin 與乳酸對(duì)維氏氣單胞菌膜電動(dòng)勢(shì)的影響

膜電動(dòng)勢(shì)的大小由熒光探針DiSC3(5)的熒光強(qiáng)度反映。DiSC3(5)能夠聚集在超極化的細(xì)胞膜表面,而進(jìn)入胞內(nèi)后熒光消失。熒光值減小即細(xì)胞膜ΔΨ上升,反之則消散。從圖5A可見(jiàn),乳酸處理組菌體反映ΔΨ的初始熒光值(4 h內(nèi))較對(duì)照組高,這一現(xiàn)象表明,經(jīng)乳酸處理后的病原體細(xì)胞膜電動(dòng)勢(shì)降低,而且革蘭氏陰性菌的熒光值此后持續(xù)降低也證明了病原微生物在反應(yīng)過(guò)程中ΔΨ不斷升高。與對(duì)照組及乳酸處理組相比,乳酸+0.05 g/L nisin處理時(shí),維氏氣單胞菌的最初熒光值較高,證明細(xì)胞膜在一剎那產(chǎn)生極化,熒光值此后持續(xù)增加,這表明細(xì)胞膜電動(dòng)勢(shì)在不斷消散。由此推測(cè),細(xì)菌素能夠?qū)?jīng)過(guò)乳酸處理的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用,nisin會(huì)導(dǎo)致菌體ΔΨ消散;而nisin質(zhì)量濃度越高,形成的孔洞也越多,其離子泄漏速率也越快,即膜電動(dòng)勢(shì)的消散速度越快。

從圖5B可見(jiàn):未經(jīng)乳酸處理的維氏氣單胞菌反映ΔpH的熒光值不斷增加,說(shuō)明菌體的膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)在這一過(guò)程中不斷上升;而經(jīng)單獨(dú)乳酸處理及在乳酸基礎(chǔ)上加入 0.05 g/L nisin 后,菌體的初始熒光值均與對(duì)照組較低,這一現(xiàn)象表明細(xì)胞膜在一瞬間產(chǎn)生了極化。此后,不斷降低的熒光值表明膜ΔpH持續(xù)消散,這一現(xiàn)象證明細(xì)菌素能夠損傷經(jīng)乳酸處理的維氏氣單胞菌,并使膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)消散;且la+nisin處理組熒光值下降幅度明顯,這表明nisin 對(duì)維氏氣單胞菌的抑制可能與其對(duì)敏感革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制機(jī)理類(lèi)似,在有乳酸的情況下,細(xì)菌素能夠侵入細(xì)胞膜,進(jìn)而導(dǎo)致離子泄漏,造成質(zhì)子動(dòng)勢(shì)消散。

2.6 nisin與乳酸對(duì)維氏氣單胞菌膜菌體結(jié)構(gòu)影響

圖6為環(huán)境掃描電子顯微鏡拍攝的維氏氣單胞菌表面形態(tài)特征,維氏氣單胞菌在LB 培養(yǎng)基中呈現(xiàn)兩端鈍圓的桿狀,菌體表面光滑飽滿(mǎn)。乳酸處理組和協(xié)同處理組的菌體表面有明顯缺失。其中,4 mmol/L乳酸環(huán)境培養(yǎng)的維氏氣單胞菌表面破損,發(fā)生嚴(yán)重形變,菌體的大小不均一(白色實(shí)線(xiàn)箭頭),這一現(xiàn)象驗(yàn)證了乳酸通過(guò)破壞細(xì)胞壁,增進(jìn)細(xì)菌素效力的假設(shè);乳酸與nisin 協(xié)同處理的維氏氣單胞菌與對(duì)照組相比發(fā)生明顯改變,菌體出現(xiàn)嚴(yán)重變形(黑色虛線(xiàn)箭頭),菌體表面可見(jiàn)較多孔洞(黑色實(shí)線(xiàn)箭頭)和裂解菌體碎片(白色虛線(xiàn)箭頭)。試驗(yàn)結(jié)果表明,乳酸與nisin可以改變維氏氣單胞菌的菌體形態(tài)。

3 討論

3.1 nisin與乳酸對(duì)維氏氣單胞菌有協(xié)同抑殺作用

本研究中通過(guò)生長(zhǎng)抑制和致死試驗(yàn)證明,乳酸鏈球菌素nisin和乳酸對(duì)維氏氣單胞菌有協(xié)同抑制和致死作用,且抑制效果隨著nisin質(zhì)量濃度的增加而提高。乳酸是乳酸菌中一類(lèi)重要抗菌代謝產(chǎn)物,對(duì)大部分微生物具有良好的控制效果。nisin是I類(lèi)乳酸菌細(xì)菌素的重要代表,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原微生物如李斯特菌屬Listeria、芽孢桿菌屬Bacillus和葡萄球菌屬Staphylococcus等病原菌具有良好的抑殺效果,但對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)效[26]。Roth等[27]曾報(bào)道過(guò)低濃度乳酸可造成革蘭氏陰性菌非致死性損傷,并提高其對(duì)細(xì)菌素的敏感性。應(yīng)用研究也發(fā)現(xiàn),產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌如嗜水氣單胞菌具有良好的控制效果[28]。產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌在食品體系中與同等產(chǎn)酸菌株相比對(duì)革蘭氏陰性菌有更強(qiáng)的抑制能力[17]。本研究中證明,4 mmol/L乳酸和0.05 g/L的nisin協(xié)同可顯著抑制維氏氣單胞菌的生長(zhǎng),延長(zhǎng)延滯期,降低最大比生長(zhǎng)速率,這將有利于生產(chǎn)中控制或推遲病原菌的增殖,降低水產(chǎn)動(dòng)物的患病風(fēng)險(xiǎn)。此外,本研究中還發(fā)現(xiàn),nisin和乳酸可以協(xié)同降低維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)性和生物被膜的形成。維氏氣單胞菌普遍具有運(yùn)動(dòng)性[29],更有利于其生存、擴(kuò)散及造成感染[30],因而抑制運(yùn)動(dòng)性能夠有效控制維氏氣單胞菌的擴(kuò)散及毒力。生物被膜是維氏氣單胞菌易造成持續(xù)感染的另一重要原因,被膜態(tài)對(duì)菌體有一定的保護(hù)作用,并有利于群體信息交流及產(chǎn)生毒力[31-32]。本研究中,在nisin與乳酸共同存在的條件下,維氏氣單胞菌形成被膜的能力受到抑制,被膜結(jié)構(gòu)變得松散。這不僅控制了群體的增殖,也能提高菌群對(duì)其他抑菌作用的敏感性[33]。nisin與乳酸協(xié)同抑菌效應(yīng)的存在有利于提高乳酸菌在環(huán)境中對(duì)病原微生物的抗性。因此,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌,可能成為無(wú)抗養(yǎng)殖大環(huán)境下提高水產(chǎn)動(dòng)物抗細(xì)菌性疾病的重要方式之一[34-37]。

3.2 nisin與乳酸協(xié)同損傷維氏氣單胞菌作用機(jī)制

nisin與乳酸對(duì)維氏氣單胞菌的協(xié)同損傷作用,可能來(lái)源于二者對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分別損傷及相互促進(jìn)作用。革蘭氏陰性菌對(duì)細(xì)菌素的抗性可能主要來(lái)源于細(xì)胞壁 (外膜) 保護(hù)[38]。去除細(xì)胞壁后抗性革蘭氏陰性菌就會(huì)對(duì)細(xì)菌素敏感[39]。Alakomi等[40]研究發(fā)現(xiàn),乳酸可以增加革蘭氏陰性菌外膜(細(xì)胞壁)的通透性。本研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)乳酸處理后,nisin可以使維氏氣單胞菌的膜電動(dòng)勢(shì) (ΔΨ) 及pH梯度 (ΔpH) 消散,說(shuō)明乳酸與nisin同時(shí)存在會(huì)對(duì)嗜水氣單胞菌內(nèi)膜完整性造成一定程度的影響,膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到干擾,進(jìn)一步降低膜內(nèi)pH,影響膜內(nèi)物質(zhì)合成和分解代謝,這與nisin對(duì)敏感陽(yáng)性菌的作用機(jī)制相似[41-42]。另一方面,掃描電鏡觀察到乳酸處理后,菌體表面有明顯的損傷,nisin和乳酸共同處理后,菌體表面出現(xiàn)更嚴(yán)重的破損和孔洞,菌體周?chē)渤霈F(xiàn)與nisin作用于革蘭氏陽(yáng)性菌類(lèi)似的外膜小泡[43]。此外,nisin對(duì)內(nèi)膜的損傷作用可能進(jìn)一步促進(jìn)乳酸進(jìn)入細(xì)胞, 造成較同等濃度下乳酸單獨(dú)存在時(shí)更為嚴(yán)重的損傷。后期深入解析nisin和乳酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)外膜的損傷過(guò)程及機(jī)理將有助于更好地理解二者協(xié)同抑菌的機(jī)制。

4 結(jié)論

1)本研究中證明了乳酸和細(xì)菌素nisin對(duì)革蘭氏陰性病原菌有協(xié)同抑制和致死作用。

2)nisin和乳酸聯(lián)用能夠有效限制維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)性,抑制其生物被膜產(chǎn)生。

3)對(duì)于被乳酸破壞外膜的維氏氣單胞菌,nisin能夠顯著增加其膜通透性,并降低其膜電動(dòng)勢(shì)和pH梯度差,這與nisin作用于敏感革蘭氏陽(yáng)性菌的機(jī)制類(lèi)似。

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