王帥，郅麗超，梁馨元，吳哲，張夢(mèng)語(yǔ)，任丹丹，何云海，汪秋寬

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 大連 116023)

籠目海帶KjellmaniellacrassifoliaMiyabe是一種可食用、藥用型經(jīng)濟(jì)藻類，廣泛分布于日本北海道南部水域，因其含有高于普通海帶3～4倍的巖藻多糖(Fucoidan)[1]，被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。目前，本研究團(tuán)隊(duì)已實(shí)現(xiàn)了籠目海帶在大連海域的育種栽培。研究表明，籠目海帶中除含有大量糖類外，還含有具有消炎、清除自由基、降血壓等多種生物活性功能的酚類物質(zhì)[2-3]。

褐藻多酚是褐藻藻體中特有的次級(jí)代謝產(chǎn)物。由于水生生物與陸生生物有著不同的生物習(xí)性和結(jié)構(gòu)，可能有不同的代謝產(chǎn)物，故褐藻類多酚有著比陸生生物多酚更高的抗氧化活性[4]。多酚結(jié)構(gòu)復(fù)雜[5-6]，對(duì)其分離純化難度較大，目前，對(duì)多酚分離純化的研究主要目的是得到活性高的粗多酚提取物、簡(jiǎn)單的粗多酚組分，或是證明該多酚化合物中含有某種已知的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)酚類物質(zhì)，尚未見(jiàn)明確表明多酚化合物具體成分組成及結(jié)構(gòu)的研究。分離純化多酚的方法包括有機(jī)溶劑萃取法、大孔樹(shù)脂吸附法、色譜柱層析法(HPLC)、凝膠柱層析法、膜技術(shù)法和高速逆流色譜制備技術(shù)(HSCCC)[7]，其中，大孔樹(shù)脂吸附分離純化應(yīng)用較為普遍。Buran等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)FPX 66大孔樹(shù)脂吸附藍(lán)莓多酚，能有效地去除多糖成分，實(shí)現(xiàn)多酚的有效純化。也有學(xué)者研究了大孔樹(shù)脂對(duì)羊棲菜Sargassumfusiforme[9]、海帶LaminariajapomicaAresch[10]、巨藻Macrocystispyrifera[11]等褐藻多酚吸附解吸的影響，結(jié)果表明，大孔樹(shù)脂分離純化褐藻多酚的效果存在差異，目前并未發(fā)現(xiàn)一種萬(wàn)能的大孔樹(shù)脂對(duì)不同種類多酚均有較強(qiáng)的純化作用。

籠目海帶作為中國(guó)一種新型的褐藻資源，目前對(duì)其多酚的分離純化研究還鮮有報(bào)道。本研究中，以大連海域栽培的籠目海帶為研究對(duì)象，利用乙醇提取粗多酚，通過(guò)不同大孔樹(shù)脂分離純化籠目海帶多酚，對(duì)其分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)考察其對(duì)DPPH自由基與羥基自由基的清除能力、總抗氧化能力，以及氧化自由基吸收能力，對(duì)粗多酚及分離純化各組分的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為籠目海帶多酚的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

籠目海帶于2018年7月收獲于大連旅順柏嵐子海域，曬干后帶回遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室備用。

試劑：大孔樹(shù)脂ADS-7(強(qiáng)極性)、ADS-8(非極性)、ADS-21(極性)、D101(弱極性)、AB-8(弱極性)、NKA-9(極性)均為天津南開(kāi)和成公司產(chǎn)品；HP-20(非極性)(日本三菱公司)、XDA-1(非極性)均為西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司產(chǎn)品；沒(méi)食子酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)(純度99.0%)、福林酚(北京市索萊寶科技有限公司)、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、水溶性維生素E(Trolox)(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)、三吡啶三吖嗪(TPTZ)(梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(TCI))、熒光素鈉、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)(北京百靈威科技有限公司)。所用各種試劑及藥品均為分析純。

儀器：SynergyH1酶標(biāo)儀(美國(guó)博騰儀器有限公司)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；BT100-2J恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；SBS-160數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 籠目海帶前處理 將籠目海帶淡干品表面的沙子、貽貝及甘露醇等物質(zhì)刷去，在60 ℃下恒溫烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎，粉末置于密封袋中，干燥避光保存?zhèn)溆谩＝?jīng)測(cè)定，該籠目海帶的巖藻聚糖硫酸酯含量為4%，其中，硫酸基團(tuán)含量為25.14%，多糖含量為63.33%。

1.2.2 籠目海帶多酚提取 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究確定籠目海帶多酚的提取工藝條件為：取16 g籠目海帶粉，以1∶50(g∶mL)的料液比加入60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇，在75 ℃條件下提取70 min，離心取上清液，沉淀以相同條件重復(fù)提取2次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇溶液后冷凍干燥得到粗多酚，真空密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大孔樹(shù)脂活化與再利用 使用前將8種大孔樹(shù)脂分別在密封條件下用無(wú)水乙醇浸泡24 h，使樹(shù)脂充分溶脹，然后用蒸餾水洗至無(wú)乙醇?xì)馕肚疑锨逡撼吻澹儆皿w積分?jǐn)?shù)為5%的稀鹽酸浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，再用質(zhì)量濃度為50 g/L的氫氧化鈉溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性備用。

1.2.4 分離籠目海帶多酚大孔樹(shù)脂類型的確定

1) pH對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響。將預(yù)處理好的8種大孔樹(shù)脂分別抽濾，稱取5 g樹(shù)脂于錐形瓶中，分別加入pH為3、4、5、6、7、8的一定質(zhì)量濃度(C0)的多酚樣液50 mL,于25 ℃恒溫振蕩器中震蕩24 h，充分吸附后，抽濾取上層清液測(cè)定多酚質(zhì)量濃度(C1)。吸附率計(jì)算公式為

(1)

其中：C0為吸附前樣液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1為吸附后上層清液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)。

2) 乙醇對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸的影響。將預(yù)處理好的8種大孔樹(shù)脂分別抽濾，稱取5 g樹(shù)脂于錐形瓶中，加入50 mL一定質(zhì)量濃度(C0)的多酚樣液，于25 ℃恒溫振蕩器中震蕩24 h，充分吸附后，取上層清液測(cè)定多酚質(zhì)量濃度(C1)。取吸附飽和的樹(shù)脂分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液50 mL，于25 ℃恒溫振蕩器中震蕩24 h，抽濾取上層清液，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度(C2)。解吸率和純度計(jì)算公式為

(2)

(3)

其中：C0為吸附前樣液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1為吸附后上層清液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)；C2為解吸后上層清液中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)。

3)不同樹(shù)脂對(duì)多酚靜態(tài)吸附性能比較。分別稱取預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂5 g，在其最適濃度的吸附(pH)、解吸(乙醇體積分?jǐn)?shù))條件下按式(1)和式 (2)，計(jì)算各種大孔樹(shù)脂的吸附率、解吸率及純度。

1.2.5 XDA-1樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)洗脫

1) 進(jìn)樣質(zhì)量濃度及進(jìn)樣體積。將一定量預(yù)處理的XDA-1型大孔樹(shù)脂濕法裝入直徑為2.6 cm×30 cm的玻璃柱中(上柱高度為20 cm)，蒸餾水平衡12 h，以1 mL/min恒定的進(jìn)樣速度分別將不同進(jìn)樣質(zhì)量濃度(15、30、45 mg/mL)的粗多酚樣液(pH 6.5)過(guò)柱子，每5 mL收集一管，測(cè)定流出液中的多酚質(zhì)量濃度。比較不同質(zhì)量濃度的樣液對(duì)該樹(shù)脂吸附多酚能力的影響，根據(jù)泄漏曲線確定進(jìn)樣體積和進(jìn)樣質(zhì)量濃度。

2) 進(jìn)樣流速。XDA-1型大孔樹(shù)脂裝柱填充方法同上。以不同流速(0.5、1.0、2.0 mL/min)將30 mg/mL的粗多酚樣液(pH 3)持續(xù)進(jìn)樣，每5 mL收集一管，測(cè)定流出液中的多酚含量，比較不同進(jìn)樣流速對(duì)吸附的影響，并確定最佳進(jìn)樣流速。

3) 樣液pH。XDA-1型大孔樹(shù)脂裝柱填充方法同上。以1 mL/min恒定的進(jìn)樣速度將不同pH(3.0、3.5、4.0)的15 mg/mL粗多酚樣液持續(xù)進(jìn)樣，每5 mL收集一管，測(cè)定流出液中的多酚含量，比較不同進(jìn)樣pH對(duì)吸附的影響，并確定最佳樣液pH。

4) 洗脫體積及洗脫液體積分?jǐn)?shù)。XDA-1型大孔樹(shù)脂裝柱填充方法同上。進(jìn)樣液100 mL(15 mg/mL粗多酚樣液、pH為3)，以1 mL/min的流速?zèng)_一個(gè)柱體積的蒸餾水，使多酚樣液完全吸附。以不同體積分?jǐn)?shù)(60%、70%、80%)的乙醇洗脫，并確定最佳乙醇洗脫液體積分?jǐn)?shù)及洗脫體積。

1.2.6 籠目海帶多酚的抗氧化活性

1)籠目海帶多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力。根據(jù)Tohidi等[12]和Chen等[13]試驗(yàn)方案稍做修改。在96孔酶標(biāo)板中，分別加入不同濃度的VC、粗多酚及純化后的多酚樣液40 μL,再加入160 μL 0.1 mmol/L DPPH醇溶液，于25 ℃下避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照并做空白試驗(yàn)和平行對(duì)照，計(jì)算各樣液對(duì)DPPH自由基的清除率，計(jì)算公式為

(4)

其中：A0為DPPH與水溶劑混合后的吸光度；A1為樣液與DPPH混合后的吸光度；A2為樣液與乙醇溶液混合后的吸光度。

2) 籠目海帶多酚對(duì)羥基自由基的清除能力。將籠目海帶粗多酚、分離純化組分P1、P2配制成適宜濃度的水溶液，如有沉淀可以8 000 r/min離心5 min取上清液。向試管中分別加入0.5 mL 9 mmol/L的水楊酸醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、0.5 mL樣液及0.5 mL 8.8 mmol/L 的H2O2溶液，于37 ℃下恒溫浴15 min，測(cè)定其在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算各樣液對(duì)·OH自由基的清除率，計(jì)算公式為

(5)

其中：A0為不加樣液的吸光度；A1為加入樣液的吸光度；A2為不加H2O2的吸光度。

3) 籠目海帶多酚的鐵離子還原力 (FRAP)。在96孔酶標(biāo)板中分別加入5 μL不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L)的FeSO4溶液和150 μL三吡啶三吖嗪TPTZ工作液(TPTZ工作液現(xiàn)用現(xiàn)配)，以蒸餾水作為空白對(duì)照，37 ℃條件下溫育40 min，測(cè)定其593 nm處的吸光度，以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，其在593 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程y=0.405 1x- 0.001 4(R2=0.996 8)。將樣品溶液代替FeSO4溶液進(jìn)行上述操作，樣品的抗氧化活性(FRAP值)以達(dá)到相同吸光度所需的FeSO4量(mmol)表示。

4) 氧自由基吸收能力(ORAC)。依次在96孔酶標(biāo)板中加入25 μL的各多酚樣液，再加入150 μL 熒光素鈉鹽溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別以濃度為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的水溶性維生素E(Trolox)繪制?？瞻捉M用75 mmol/L磷酸緩沖液代替。酶標(biāo)儀中37 ℃下溫育10 min，立即加入25 μL的AAPH溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)538 nm條件下進(jìn)行持續(xù)檢測(cè)，測(cè)定時(shí)間為3 h。初始的熒光強(qiáng)度記為F0，之后每2 min檢測(cè)一次，記為F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，…，F(xiàn)n。相對(duì)熒光強(qiáng)度為各時(shí)間點(diǎn)絕對(duì)熒光強(qiáng)度F與初始絕對(duì)熒光強(qiáng)度之比，記為f0，f1，f2，…，fn。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，保護(hù)面積NetAUC為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.367 5x-1.639 6 (R2=0.977 36)。將樣品物質(zhì)在自由基作用下的熒光衰退曲線的保護(hù)面積NetAUC帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到與各個(gè)樣品組分多酚的氧自由基吸收能力等價(jià)的Trolox濃度，最后ORAC值以μmol Trolox/g多酚干質(zhì)量表示。計(jì)算公式為

AUC=2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn，

(6)

保護(hù)面積NetAUC=AUC抗氧化劑-AUC+AAPH。

(7)

1.2.7 籠目海帶多酚含量的測(cè)定 采用Flion-Ciocalteu法[15]測(cè)定總多酚的含量，并做部分修改。取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，在760 nm處測(cè)定其吸光度值，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.042 2+0.054 2X(R2=0.999 6),以沒(méi)食子酸(GA)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總酚含量(mg GA/g樣品提取物干質(zhì)量)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

從圖1可見(jiàn)，ADS-7、ADS-21型大孔樹(shù)脂吸附的最適pH為4，其他大孔樹(shù)脂的最適吸附pH均為3，該結(jié)果表明，氫離子在一定程度上促進(jìn)了多酚在大孔樹(shù)脂上的吸附。這可能是多酚呈弱酸性,在酸性條件下多以分子形式存在，而在堿性環(huán)境中發(fā)生電離以離子形式存在，不易被吸附。但酸性過(guò)強(qiáng)(pH<3)時(shí)，多酚純化液顏色明顯呈現(xiàn)出不同的綠色，考慮到對(duì)樣品的保護(hù)及試驗(yàn)安全性，不宜采用強(qiáng)酸條件進(jìn)行試驗(yàn)。

從圖2可見(jiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，各種大孔樹(shù)脂的解吸率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但各種大孔樹(shù)脂的最適乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)有所不同，其中D101最適的乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)為60%，ADS-7為90%，其余樹(shù)脂最適的乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)均為70%。

在上述各種大孔樹(shù)脂最適樣液pH和乙醇洗脫條件下，進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)。從圖3可見(jiàn)：各種大孔樹(shù)脂對(duì)籠目海帶多酚均具有較好的吸附性能；XDA-1型大孔樹(shù)脂的吸附率最高(平均為73.38%), 與其他大孔樹(shù)脂存在顯著性差異(P<0.05)，ADS-7的吸附率次之(平均為72.44%)，再次為ADS-21(平均為63.67%)、ADS-8(平均為62.55%)。綜合考慮吸附率、解吸率及純度，后期選擇XDA-1型大孔樹(shù)脂對(duì)籠目海帶多酚進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

2.2 XDA-1型樹(shù)脂分離條件優(yōu)化

2.2.1 進(jìn)樣流速的確定 從圖4可見(jiàn)，進(jìn)樣流速小時(shí)，有利于其吸附，較慢流速使多酚在層析柱中停留時(shí)間較長(zhǎng)，能夠讓樹(shù)脂與多酚充分接觸?？偟膩?lái)看，進(jìn)樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率影響較小，考慮到實(shí)際分離純化的效率和對(duì)分離柱的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)中選擇1.0 mL/min的流速進(jìn)樣。

2.2.2 進(jìn)樣質(zhì)量濃度及進(jìn)樣體積的確定 從圖5A和表1可見(jiàn)：當(dāng)進(jìn)樣體積達(dá)到45 mL時(shí)，多酚開(kāi)始出現(xiàn)泄露，當(dāng)進(jìn)樣液質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，其流出液體積為100 mL時(shí)達(dá)到吸附動(dòng)態(tài)平衡，平衡時(shí)吸附率與對(duì)其他質(zhì)量濃度樣液的吸附率存在顯著性差異(P<0.05)，其吸附率平均為71.21%；當(dāng)進(jìn)樣液質(zhì)量濃度為30、45 mg/mL時(shí)，泄漏點(diǎn)也為45 mL，但在130～150 mL時(shí)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，平均吸附率分別為53.59%和38.49%。因此，選擇進(jìn)樣液質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)效果最佳。本研究中考慮到實(shí)際生產(chǎn)分離的效率，未選取泄漏點(diǎn)時(shí)的體積為進(jìn)樣體積，而是選取進(jìn)樣量達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附平衡時(shí)的體積為進(jìn)樣體積，即為100 mL。

表1 不同進(jìn)樣質(zhì)量濃度、pH下籠目海帶多酚的吸附率

2.2.3 進(jìn)樣液pH的確定 從圖5B和表1可見(jiàn)：進(jìn)樣液的pH在3.0～4.0范圍時(shí)，隨著pH的增大，多酚的吸附率逐漸降低，可能是由于多酚大量的羥基呈弱酸性，在酸性條件下更容易被樹(shù)脂吸附；當(dāng)pH為3.0時(shí)多酚的吸附率與pH為3.5和4.0時(shí)存在顯著性差異(P<0.05)，考慮到分離的得率，選擇pH為3時(shí)樣品進(jìn)樣最佳，此時(shí)的吸附率最高，為73.75%。

2.2.4 洗脫體積及乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 由靜態(tài)解吸試驗(yàn)可知，70%的乙醇解吸的多酚含量最高，因此，本試驗(yàn)中選取60%、70%、80%的乙醇解吸XDA-1樹(shù)脂，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)籠目海帶多酚的洗脫曲線如圖6所示，從整體上看，洗脫75 mL時(shí)出峰，洗脫液達(dá)到115 mL時(shí)第一個(gè)峰(P1)洗脫完畢，洗脫液達(dá)到200 mL時(shí)第二個(gè)峰(P2)洗脫完畢，之后無(wú)明顯峰。由此，確定洗脫體積為200 mL(即2 BV)。洗脫曲線與x軸圍成的面積即為洗脫面積，其大小可表示洗脫量，因此，比較60%、70%、80%乙醇的洗脫曲線面積，可知60%乙醇洗脫出的兩個(gè)峰面積較小，即多酚含量相對(duì)較低，70%乙醇洗脫P(yáng)1峰形尖銳，且峰面積較大，P2組分峰形與80%乙醇洗脫曲線面積相當(dāng)，綜合考慮選取體積分?jǐn)?shù)較低的70%乙醇為洗脫劑較佳。

2.2.5 籠目海帶多酚含量 本研究中，最終確定XDA-1型大孔樹(shù)脂為籠目海帶多酚最佳洗脫樹(shù)脂，其最適洗脫條件為pH為3的15 mg/mL樣液以1 mL/min的流速進(jìn)樣100 mL，70%乙醇洗脫200 mL(2 BV)。在此條件下，經(jīng)XDA-1型大孔樹(shù)脂分離純化得到組分P1、P2，其多酚含量分別為(44.62±6.61)、(10.45±0.02)mg GA/g，而籠目海帶未純化的粗多酚含量?jī)H為(2.84±0.15) mg GA/g。經(jīng)大孔樹(shù)脂分離純化后其多酚含量有顯著提高(P<0.05)。

2.3 籠目海帶多酚的體外抗氧化活性

籠目海帶粗多酚及其分離純化的各組分均有一定的抗氧化活性,籠目海帶多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力不如抗氧化劑VC；多酚各組分之間相比，粗多酚與P2組分無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但二者均與P1組分有顯著性差異(P<0.05)，其中，P1組分清除DPPH自由基的IC50比粗多酚低23.5%(表2)。

籠目海帶多酚對(duì)羥自由基的清除能力明顯優(yōu)于VC;籠目海帶粗多酚清除羥自由基的IC50為(148.77±5.26)μg/mL，XDA-1型大孔樹(shù)脂分離純化的P1與P2組分的IC50與VC組分間存在顯著性差異(P<0.05)(表2)。

籠目海帶粗多酚、P1、P2組分和VC在鐵離子還原力FRAP測(cè)定中均顯示出一定的抗氧化活性，純化后的P2多酚組分比粗多酚的抗氧化活性有顯著性提高(P<0.05);P2組分的FRAP值為(16.43±0.89)mmol FeSO4/g，P1組分的鐵離子還原力與VC相當(dāng)(P>0.05)(表2)。

籠目海帶粗多酚的氧化自由基吸收能力ORAC與VC能力相當(dāng)(P>0.05)，分離純化的P1、P2組分，其氧化自由基吸收能力與粗多酚存在顯著性差異(P<0.05)，其中P2組分的ORAC值為VC的35.6倍，顯示出良好的抗氧化活性(表2)。

表2 籠目海帶多酚的體外抗氧化活性Tab.2 Antioxidant activities in vitro of polyphenols from brown alga Kjellmaniella crassifolia Miyabe

3 討論

3.1 大孔樹(shù)脂的分離純化

本研究中，利用XDA-1樹(shù)脂有效分離純化了籠目海帶多酚,在動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中，綜合考慮到較慢流速能使多酚在層析柱中停留較長(zhǎng)時(shí)間，可與樹(shù)脂充分接觸[16]，進(jìn)樣濃度低可減少雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性吸附和避免樣品絮狀懸浮或沉淀[17]，進(jìn)樣體積少(泄漏點(diǎn)時(shí)為進(jìn)樣體積)會(huì)減少實(shí)際生產(chǎn)效率[18]等因素的影響，確定分離純化條件，得到兩個(gè)分離組分P1、P2,P1凍干粉為紅棕色，P2為黃綠色。本研究中推測(cè)組分的差異可能與溶劑極性相關(guān)，這與Sun 等[19]的研究結(jié)果相似。當(dāng)加入70%乙醇洗脫時(shí)，其體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，P1可能為低濃度醇洗脫組分，極性比P2組分大。

目前，研究報(bào)道的褐藻多酚組分通常為混合組分[20]。大孔樹(shù)脂是分離純化多酚類物質(zhì)的常用手段，后期可將HPLC、HPLC-MS等技術(shù)應(yīng)用于大孔樹(shù)脂分離純化多酚組分的分析，為進(jìn)一步分析多酚結(jié)構(gòu)提供幫助。童鑫等[21]通過(guò)HPLC技術(shù)將HPD-300大孔樹(shù)脂分離純化前后的米糠酚類提取物的總酚含量、已知各種酚單體含量及總黃酮類含量進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，大孔樹(shù)脂HPD-300對(duì)米糠酚類物質(zhì)分離效果顯著，但HPLC技術(shù)只能在確定是否含有及含有量上提供多酚相關(guān)數(shù)據(jù)變化，不能檢測(cè)出多酚全部單體種類。Abolulla等[6]通過(guò)HPLC-QTOF-MS技術(shù)在不同碰撞能量(CE)值下以負(fù)電噴霧電離(ESI)模式定性分析了多酚化合物，在研究的石榴皮提取物中共檢測(cè)出35種可水解單寧和15種類黃酮，并首次在石榴皮中鑒定出六羥基二苯甲酰基-戊烯?；?葡糖苷(HHDP-戊烯酰基-葡萄糖苷)。因此，今后還需結(jié)合多種分析手段探索籠目海帶多酚的結(jié)構(gòu)，以明確其具體結(jié)構(gòu)信息。

3.2 籠目海帶多酚及各組分的抗氧化活性

Akowuah 等[22]研究了不同極性萃取劑提取的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)，5種提取劑(水、50%甲醇、甲醇、70%丙酮和氯仿)提取腎茶Orthosiphonstamineus多酚，其中，70%丙酮提取物表現(xiàn)出最高的DPPH自由基清除能力，檢測(cè)丙酮提取物中含有較高的3′-羥基-5,6,7,4′-四甲氧基黃酮(3′-hydroxy-5,6,7,4′-tetramethoxyflavone, TMF)，其次為甲醇提取物中有較高含量的迷迭香酸(rosmarinic acid, RA)。本研究中考慮到籠目海帶中多糖對(duì)多酚提取的影響及提取產(chǎn)率等因素，選取了60%乙醇溶液提取多酚，推測(cè)可能與甲醇提取物相似。相比其他藻類多酚，籠目海帶P1組分對(duì)DPPH自由基清除能力比龍須菜GracilarialemaneUbrmis粗酚[23]高20%?；\目海帶多酚對(duì)羥自由基的清除能力明顯優(yōu)于VC，這與楊小青[24]的研究結(jié)果一致，有力地證明了在清除羥基自由基方面褐藻多酚有著較強(qiáng)的能力。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，多酚含量高的P1組分，其清除羥基自由基的能力遠(yuǎn)不及P2組分，P1可能是由于低濃度醇洗脫組分，因此，其分子量大或極性較大，多酚聚合度較高，其空間構(gòu)象影響了羥基活性，隨著多酚聚合度的增加，其抗氧化能力減弱[25-26]。而極性較弱的P2對(duì)羥自由基的IC50僅為VC的5%，其可作為極具潛力的天然抗氧化劑?；\目海帶粗多酚的ORAC值比Wang 等[27]測(cè)得的墨角藻、泡葉藻、北方海帶等8種藻多酚的氧化自由基清除能力強(qiáng)，顯示出良好的抗氧化活性。

4 結(jié)論

1)本研究中確定了XDA-1型大孔樹(shù)脂為籠目海帶多酚的最適純化樹(shù)脂，并通過(guò)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)分離得到P1、P2兩個(gè)組分。

2)通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，籠目海帶多酚分離組分具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中，P2抗氧化活性顯著優(yōu)于多酚其他組分。

3)與其他褐藻相比，新品種籠目海帶多酚抗氧化活性較高，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。分離純化的籠目海帶多酚可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。