楊豐，王逸鑫，沈思遠，吳涵，施文正、2，汪之和、2、3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306； 2.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)，上海 201306； 3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii的頭胸甲內(nèi)具有近似于蟹黃的獨特風味[1]，且活體蝦的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值更高，因此，其活體的儲運顯得尤為重要。?；钸\輸過程中為降低蝦體的應(yīng)激反應(yīng)及物理損傷等，往往通過麻醉法以鎮(zhèn)靜活體[2]。目前，報道使用的麻醉劑有MS-222、乙二醇苯醚、丁香酚、苯唑卡因等[3]，但使用這些化學藥物均存在安全隱患，且對蝦體的麻醉效果不佳。Coyle等[4]研究表明，僅丁香酚對羅氏沼蝦有效；李全[5]用乙醇麻醉羅氏沼蝦發(fā)現(xiàn)，高濃度乙醇極易造成蝦體死亡，而較低濃度的乙醇麻醉時間較長。已有研究表明，CO2對水產(chǎn)動物具有麻醉作用，且無藥物殘留和休藥期，可直接在市場銷售[6]，具有安全、高效、經(jīng)濟等特點。目前，CO2麻醉法已廣泛應(yīng)用于魚類活運研究，但在蝦類(甲殼類)的研究中鮮有報道，尤其對影響蝦體?；钸\輸因素的探究及保活工藝等基礎(chǔ)原理性方面尚待進一步研究。

本研究中，采用CO2麻醉法保活運輸羅氏沼蝦，通過確定羅氏沼蝦麻醉與復(fù)蘇階段分期，研究了CO2麻醉濃度、?；顪囟?、蝦水質(zhì)量比對其?；钚Ч挠绊?，并通過檢測水質(zhì)指標及蝦體不同組織部位指標的變化，研究了影響羅氏沼蝦?；畹臋C理，以期為羅氏沼蝦?；钸\輸提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅氏沼蝦購于上海市浦東新區(qū)新蘆苑集貿(mào)市場，充氧水運至實驗室后，于暫養(yǎng)池中饑餓暫養(yǎng)24 h，水溫為(25±1)℃，體質(zhì)量為20～30 g，體長為10～15 cm。其中，暫養(yǎng)及?；钣盟鶠槌浞制貧夂蟮淖詠硭?。

試驗儀器:JPB-607型便攜式溶解氧測定儀(上海精密科學儀器有限公司)；FE28型pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；5B-3N型便攜式氨氮測定儀(上海連華實業(yè)有限公司)；UV-1800PC紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；WS60CO2035二氧化碳電極(上海水儀科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 羅氏沼蝦麻醉與復(fù)蘇程度 根據(jù)相關(guān)研究并結(jié)合羅氏沼蝦在不同濃度CO2麻醉液中的實際行為反應(yīng)，將麻醉程度分為A1～A4階段，復(fù)蘇程度分為R1～R3階段(表1、表2)。將麻醉處理后的羅氏沼蝦放入正常充空氣的試驗用水中復(fù)蘇，一段時間后用玻璃棒觸碰，有應(yīng)激反應(yīng)者視為活體，經(jīng)反復(fù)刺激仍然無反應(yīng)者視為死亡。

表1 麻醉階段分期及其行為特征

1.2.2 CO2質(zhì)量濃度、保活溫度和?；钗r水質(zhì)量比對蝦體存活時間與存活率的單因素試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，在CO2質(zhì)量濃度180 mg/L、?；顪囟?0 ℃和保活蝦水質(zhì)量比1∶12條件下，固定其中兩個因素，分別進行不同CO2質(zhì)量濃度、不同?；顪囟群筒煌；钗r水質(zhì)量比對蝦體麻醉及?；畹挠绊懺囼灐Ｃ總€試驗組均設(shè)3個平行，每個平行用蝦25尾，分別在試驗的第0、12、24、36、48 h進行觀察，計算其?；顣r間和存活率。

存活率=存活蝦數(shù)量/試驗蝦總數(shù)量×100%。

1)麻醉過程中CO2質(zhì)量濃度選擇試驗。試驗設(shè)60、120、180、240、300 mg/L 5個CO2質(zhì)量濃度組，將暫養(yǎng)24 h后活力正常的蝦體放入不同質(zhì)量濃度的CO2麻醉液中，麻醉全程處于密封狀態(tài)，待蝦體達到A4深度麻醉階段時，及時轉(zhuǎn)移至保活箱中。觀察不同質(zhì)量濃度CO2的蝦體麻醉和復(fù)蘇效果，以及對蝦體存活時間及存活率的影響效果。

麻醉液的配制：在常溫狀態(tài)下向水體充入純氧(5 min)，再通入混合氣體(CO2∶O2=1∶1)，通過控制氣體流速和通入時間，得到不同質(zhì)量濃度的CO2麻醉液(CO2濃度采用CO2氣敏選擇性電極測定)，密封狀態(tài)下靜置5 min后進行蝦體麻醉試驗。

2)?；钸^程中蝦水質(zhì)量比選擇試驗。試驗設(shè)1∶3、1∶6、1∶9、1∶12共4個蝦水質(zhì)量比組，采用靜態(tài)?；罘ǎ瑢⒙樽砗蟮奈r體迅速轉(zhuǎn)移至不同蝦水質(zhì)量比的?；钕鋬?nèi)。

3)?；钸^程中溫度選擇試驗。試驗設(shè)12、16、20、25 ℃ 4個溫度組，以1～2 ℃/h降溫或升溫速率控制保活箱內(nèi)的溫度。

1.2.3 正交試驗 采用正交試驗考察CO2麻醉質(zhì)量濃度(150、180、210 mg/L)、?；顪囟?18、20、22 ℃)、保活蝦水質(zhì)量比(1∶8、1∶9、1∶10)對羅氏沼蝦?；钚Ч挠绊?，分別以保活48 h羅氏沼蝦的存活率和?；?4 h水體總氨氮質(zhì)量濃度為考核指標，確定最佳條件并進行驗證試驗。

1.2.4 最佳麻醉及?；顥l件下水體理化、細菌總數(shù)及蝦體能量、酶活性指標的變化試驗 以正交優(yōu)化后的最佳條件(CO2麻醉質(zhì)量濃度為150 mg/L、?；顪囟葹?8 ℃、蝦水質(zhì)量比為1∶10)進行試驗，從?；钏|(zhì)環(huán)境、蝦體本身生理生化等方面探究CO2麻醉處理對羅氏沼蝦保活的影響，并設(shè)置在常溫下未經(jīng)CO2麻醉處理的?；罱M為試驗對照組。

1)保活過程中水體指標的測定。麻醉組和對照組在?；钸^程中48 h內(nèi)的不同時間段從?；钕渲须S機取水樣，采用5B-3N便攜式氨氮測定儀、pH計、溶氧測定儀分別測定氨氮質(zhì)量濃度、pH和溶解氧含量，根據(jù)標準GB4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物檢驗：菌落總數(shù)測定》的平板計數(shù)法(APC)測定細菌總數(shù)。

2)?；钸^程中蝦體生理生化指標的測定。麻醉組和對照組在?；钸^程中48 h內(nèi)的不同時間段隨機取蝦樣20尾，采集血液、肝臟和肌肉進行指標測定。

血液生化指標的測定：蝦血液谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肝臟糖原、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、肌肉糖原、乳酸含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

肌肉pH測定：稱取5 g蝦肌肉樣品，加入45 mL蒸餾水，均質(zhì)2 min后冷凍離心10 min(5 000 r/min、4 ℃)，過濾后取上清液進行pH測定。

肌肉核苷酸(ATP)含量測定：參照楊陽[7]的方法略有改動。采用Waters2695高效液相色譜儀測定。稱取5 g肌肉樣品，加入10 mL的10%高氯酸(PCA)，均質(zhì)、配平，冷凍離心15 min(4 ℃、10 000 r/min)，取上清液，再加入5 mL的5%PCA溶液分兩次洗滌沉淀物，離心，合并3次上清液，用KOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，定容至50 mL，用0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存，待上機。

高效液相色譜條件：流動相，A為色譜級甲醇溶液，B為0.05 mol/L的磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀(1∶1)混合溶液，使用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.5；等梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為254 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，試驗結(jié)果采用SPSS 24.0進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CO2質(zhì)量濃度對羅氏沼蝦的麻醉效果

從表3、表4可見，隨著CO2質(zhì)量濃度的增加，麻醉時間逐漸縮短，而復(fù)蘇時間相應(yīng)增加，但在17 min內(nèi)均能達到100%復(fù)蘇。

表3 羅氏沼蝦在不同CO2質(zhì)量濃度麻醉液中的麻醉情況

表4 羅氏沼蝦在不同CO2質(zhì)量濃度麻醉液中的復(fù)蘇情況

2.2 不同CO2麻醉質(zhì)量濃度下羅氏沼蝦的存活率

將麻醉后的蝦放入溫度為20 ℃、蝦水質(zhì)量比為1∶12的水體中?；?，不同CO2麻醉質(zhì)量濃度對羅氏沼蝦保活時間和存活率的影響如圖1所示。從圖1可見：CO2質(zhì)量濃度對羅氏沼蝦的保活時間和存活率有顯著性影響(P<0.05)；CO2質(zhì)量濃度為240、300 mg/L時，保活24 h后的存活率均低于50%；CO2質(zhì)量濃度為60、120 mg/L時，在?；?6 h后的存活率明顯下降(P<0.05)；而麻醉液質(zhì)量濃度為180 mg/L時?；钚Ч詈?，?；?8 h的存活率仍在50%以上，故選擇CO2麻醉質(zhì)量濃度為180 m/L較適宜。

2.3 不同?；顪囟认铝_氏沼蝦的存活率

蝦體經(jīng)180 mg/L的CO2麻醉液麻醉后，放入蝦水質(zhì)量比為1∶12的水體中?；睿煌；顪囟葘α_氏沼蝦?；顣r間和存活率的影響如圖2所示。從圖2可見：20 ℃下，保活48 h的存活率依然達到70%以上；12、16 ℃下?；?4 h已基本死亡；25 ℃下雖然在保活初期保持較高存活率，但?；?6、48 h的存活率顯著降低(P<0.05)，故選擇?；顪囟葹?0 ℃較為適宜。

2.4 不同蝦水質(zhì)量比下羅氏沼蝦的存活率

蝦體經(jīng)180 mg/L的CO2麻醉液麻醉后，放入溫度為20 ℃的水體中?；?，不同蝦水質(zhì)量比對羅氏沼蝦?；顣r間和存活率的影響如圖3所示。從圖3可見，隨著水量增加，羅氏沼蝦的?；顣r間和存活率均呈上升趨勢；蝦水質(zhì)量比高于1∶9時，對其?；钚Чa(chǎn)生明顯影響，蝦水質(zhì)量比在1∶9和1∶12時?；?8 h內(nèi)均有較高存活率且二者變化不顯著(P>0.05)，綜合考慮實際應(yīng)用成本，選擇蝦水質(zhì)量比為1∶9較為適宜。

2.5 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇CO2麻醉質(zhì)量濃度(150、180、210 mg/L)、?；顪囟?18、20、22 ℃)、蝦水質(zhì)量比(1∶8、1∶9、1∶10)進行3因素3水平L9(34)[12]正交試驗，并進行方差分析，結(jié)果見表5～表7，其中，CO2麻醉質(zhì)量濃度、保活溫度和蝦水質(zhì)量比對羅氏沼蝦存活率及水體總氨氮質(zhì)量濃度具有顯著性影響(P<0.05)，各因素影響不同參考指標的主次關(guān)系均為A(CO2質(zhì)量濃度)>B(?；顪囟?>C(蝦水質(zhì)量比)，影響存活率的最佳水平組合為A1B1C3，即CO2麻醉質(zhì)量濃度為150 mg/L、?；顪囟葹?8 ℃、蝦水質(zhì)量比為1∶10。

表5 羅氏沼蝦CO2麻醉?；钫辉囼炘O(shè)計及結(jié)果

表6 方差分析表(因變量：存活率)Tab.6 ANOVA table (dependent variable: survival rate)

表7 方差分析表(因變量：總氨氮質(zhì)量濃度)Tab.7 ANOVA table (dependent variable: total ammonia nitrogen concentration)

2.6 最佳條件的驗證試驗

對正交試驗結(jié)果進行驗證，羅氏沼蝦經(jīng)質(zhì)量濃度為150 mg/L CO2麻醉后，在?；顪囟葹?8 ℃、蝦水質(zhì)量比為1∶10的條件下進行保活試驗，?；?8 h內(nèi)存活率達90%以上，水體總氨氮質(zhì)量濃度控制在20 mg/L以下。存活率比對照組提高了40%，總氨氮質(zhì)量濃度下降了44%。在此條件下，蝦的麻醉和復(fù)蘇效果最好，在一定程度上降低了新陳代謝、耗氧，減緩了排泄，抑制了微生物的快速生長和繁殖，并保持了水體環(huán)境。

2.7 影響羅氏沼蝦?；钜蛩氐姆治?/h3>

2.7.1 水質(zhì)指標的變化 在最佳CO2麻醉及?；顥l件下，考察水體理化指標及細菌總數(shù)的變化。從表8可見：試驗過程中，麻醉組水體pH低于對照組；麻醉組48 h水體溶氧量為(6.45±0.53)mg/L，略高于對照組(5.86±0.63)mg/L(P>0.05)；隨?；顣r間延長，各組細菌總數(shù)和總氨氮濃度均顯著上升(P<0.05)，但其麻醉組均低于對照組。因此，水體中pH、溶氧量、總氨氮濃度和細菌總數(shù)均是影響蝦體?；钸\輸存活率的主要原因。

表8 ?；钸^程中水質(zhì)及細菌總數(shù)的變化Tab.8 Changes in water quality and total bacterial count during keep-alive process

2.7.2 蝦體肌肉、血液和肝臟指標的變化 在?；?4～48 h內(nèi)，對照組肌肉糖原、乳酸、pH和ATP均有顯著性變化(P<0.05)，而麻醉組的變化相對比較平緩，尤其是肌肉糖原、乳酸；?；?8 h時，麻醉組和對照組肌糖原含量較0 h分別降低了48.97%和68.75%，麻醉組乳酸含量比對照組低，而pH和ATP含量較對照組高(圖4A、B、C、D)，因而麻醉組?；顣r間更長、存活率也更高。

麻醉組和對照組血液AST和ALT活力均顯著上升(P<0.05)，但麻醉組始終低于對照組(圖4E、F)。麻醉組血液AST和ALT酶活力也不同程度地出現(xiàn)上升，這可能是由于急性溫度脅迫使羅氏沼蝦產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)所致。這表明，CO2麻醉?；钅茉谝欢ǔ潭壬嫌行Ы档瓦@種影響。

麻醉組和對照組肝糖原含量在0～24 h均顯著下降(P<0.05)，但麻醉組下降幅度小，48 h時麻醉組和對照組較?；钋?0 h)分別降低了61.34%和75.78%(圖4G)。

隨?；顣r間延長，各組肝臟T-SOD活力呈先下降后上升趨勢，而MDA含量則呈先上升后下降趨勢，麻醉組比對照組均提前12 h變化(圖4H、I)。這表明，蝦體抗氧化防御系統(tǒng)能及時清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基且抗氧化能力可恢復(fù)。

3 討論

3.1 CO2麻醉質(zhì)量濃度、?；顪囟群臀r水質(zhì)量比對羅氏沼蝦存活率的影響

本研究結(jié)果表明，CO2麻醉質(zhì)量濃度、?；顪囟群臀r水質(zhì)量比均對羅氏沼蝦的存活率有顯著性影響，當CO2質(zhì)量濃度高于150～210 mg/L時，蝦體在麻醉階段的生理耐受壓力迅速上升，蝦體本身因細胞能量代謝所產(chǎn)生的CO2不能及時排出體外，導致蝦體在保活過程中長期處于酸堿環(huán)境失衡的狀態(tài)，進而使蝦體內(nèi)血液的載氧能力下降，出現(xiàn)窒息甚至死亡[8]；而較低CO2質(zhì)量濃度也使蝦體在保活過程中快速復(fù)蘇，無法長期有效降低蝦體新陳代謝，從而使水質(zhì)逐漸變差，造成蝦體能量的快速消耗。

?；顪囟瓤刂圃?8～22 ℃可有效提高羅氏沼蝦的存活率，這一結(jié)果與Coyle等[9]得出的有水運輸羅氏沼蝦適宜溫度為21 ℃的結(jié)果基本相似。作為熱帶蝦類的羅氏沼蝦，其生存最適溫度為22～30 ℃，適當?shù)牡蜏乜捎行Ы档臀r體新陳代謝，尤其與CO2麻醉協(xié)同作用可一定程度上延緩蝦體的復(fù)蘇，使其在較長一段時間處于低氧耗、低能耗的狀態(tài)，從而延長?；畹臅r間和提高存活率。

當前實際水產(chǎn)品活運過程中，依然以有水運輸為主，綜合考慮經(jīng)濟效益、存活率和?；顣r間等各方面因素，在CO2質(zhì)量濃度和?；顪囟燃榷ǖ那闆r下，蝦水質(zhì)量比選擇1∶8～1∶10較為適宜，此條件下可以較好地保持水體環(huán)境，一定程度上起到稀釋水體氨氮濃度的作用。

3.2 CO2麻醉處理對?；钸^程中水質(zhì)指標的影響

適宜羅氏沼蝦正常生存的水體溶氧量≥4.0 mg/L，pH為7.0～8.5[10]。本試驗中，水體溶解氧因?；钇陂g持續(xù)充氧均在合理范圍內(nèi)變化，而對照組pH超標。麻醉組的pH、氨氮質(zhì)量濃度、細菌總數(shù)均低于對照組，這與麻醉組蝦代謝低于對照組、排泄物少、耗氧量低、微生物生長繁殖速度慢有一定關(guān)系。麻醉組保活48 h總氨氮質(zhì)量濃度為(16.91±0.39)mg/L，顯著低于對照組的總氨氮質(zhì)量濃度(35.79±0.25)mg/L，這說明CO2麻醉處理結(jié)合溫度控制能有效降低蝦體代謝產(chǎn)生氨氮，延長?；顣r間和存活率。隨著?；顣r間的延長，水體成分會繼續(xù)發(fā)生變化，總氨氮質(zhì)量濃度增加、溶氧量下降、細菌總數(shù)增加，而氨氮中的非離子氨對蝦體有直接的毒性，會破壞蝦鰓組織，使蝦體血液和組織中氨濃度升高，從而降低血液載氧能力，導致代謝功能失?；蚪M織機能損傷[11]。

3.3 CO2麻醉處理對?；钸^程中羅氏沼蝦肌肉、血液和肝臟組織指標的影響

肌肉組織的糖原、乳酸、pH和ATP的變化能反映機體內(nèi)能量代謝的消耗[12]。本試驗在保活過程中，隨著水體細菌大量滋生、氨氮濃度上升和溶解氧含量下降，引起機體有氧代謝強度逐漸降低，肌糖原酵解上升，乳酸增加，肌肉pH和ATP含量下降。這一結(jié)果與Barcellos等[13]研究克林雷氏鲇R.quelen的饑餓脅迫過程中糖原含量變化相似，均與水體氧分壓下降而導致的機體肌糖原消耗有關(guān)[14-16]。Weber等[17]在使用不同麻醉劑麻醉Senegalesesole的應(yīng)激反應(yīng)研究中指出，麻醉劑能使乳酸濃度升高。Samet等[18]研究斑節(jié)對蝦Penaeusjaponicus及Bernardi等[19]研究美國龍蝦Homarusamericanus的無水?；顣r，均得到乳酸含量持續(xù)升高的結(jié)果，并認為乳酸是無氧代謝的最終產(chǎn)物。

血液中的酶活是反映蝦體健康水平的重要生化指標，正常情況下，ALT主要存在于肝臟細胞中，是評判肝臟損傷水平的重要指標[20]。AST主要存在于心肌細胞中，可反映心肌的受損程度[21]。本研究結(jié)果顯示，保活過程中，對照組羅氏沼蝦AST和ALT活性明顯高于麻醉組，說明對照組?；钇陂g蝦體新陳代謝旺盛促使水質(zhì)惡化，造成肝臟細胞急劇損傷和心肌收縮力加強，負荷超重[22-23]，進而導致細胞物理通透性增加[24]，使AST和ALT大量釋放到血液中。高權(quán)新等[25]研究銀鯧幼魚急性溫度脅迫時也得到相同的結(jié)論。

本試驗在?；钸^程中，蝦體肝糖原和肌糖原下降趨勢保持一致，但肝糖原的能量供給明顯高于肌糖原，這可能因為由應(yīng)激因子引起的糖原消耗主要來自肝臟，而肌糖原的變化主要與肌肉活動有關(guān)。MDA及T-SOD通常作為常用指標共同判斷機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，MDA含量可反映機體自由基產(chǎn)生及脂質(zhì)氧化的程度，并間接反映細胞損傷程度[26]。T-SOD活力可反映機體清除自由基的能力 具有保護細胞免受氧化損傷的作用[27]。本試驗中，在?；?2 h內(nèi)，麻醉組羅氏沼蝦肝臟T-SOD活力低于對照組，這可能是溫度控制和CO2麻醉的雙重作用，使蝦體內(nèi)氧化-抗氧化平衡得以維持良好，這也進一步說明CO2麻醉和低溫所引起的應(yīng)激未對蝦體免疫功能造成破壞，而后麻醉組T-SOD活力的上升可能是由于耗氧量增加而產(chǎn)生大量超氧陰離子，以降低氧化損傷[28]。?；?2 h后蝦體肝臟MDA含量逐漸下降，說明隨著蝦體的復(fù)蘇，水質(zhì)惡化及蝦體本身的代謝對機體產(chǎn)生一定的毒性作用，誘導機體肝臟抗氧化酶系統(tǒng)清除機體產(chǎn)生的活性氧。由此也進一步證實蝦體在麻醉CO2階段和保活前期并未受到損傷。

4 結(jié)論

1)在CO2麻醉結(jié)合溫度控制的條件下，當CO2質(zhì)量濃度為150 mg/L、?；顪囟葹?8 ℃、蝦水質(zhì)量比為1∶10時，羅氏沼蝦?；?8 h內(nèi)的存活率為90%以上，?；钸^程中水質(zhì)總氨氮質(zhì)量濃度、細菌總數(shù)、pH和溶氧量均得到有效控制，且均為影響蝦體保活存活率的主要因素。

2)蝦體肌肉能量在一定范圍內(nèi)消耗，麻醉雖對蝦體肝臟和心肌均造成一定程度損傷，但在一定時間內(nèi)能保證蝦體正常生存，尤其可使蝦體內(nèi)氧化-抗氧化平衡維持良好，在麻醉階段和保活初期，CO2麻醉和低溫所引起的應(yīng)激未對蝦體體液免疫造成破壞。因此，CO2麻醉處理對于提高羅氏沼蝦保活過程中的存活率和延長其?；顣r間是一種可行有效的方法。