覃寶利，王宣朋，單金峰，丁辰龍

(江蘇省農業(yè)科學院宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800)

硒是一種微量元素，以劑量依賴的方式影響生物體，具有抗癌作用，在哺乳動物發(fā)育、免疫和延緩衰老中起著重要作用[1]。人體如果缺硒，將會導致多種疾病的發(fā)生。在自然界中硒多以無機硒形式存在，生物利用度低且易引起硒中毒，而有機硒毒性低、生物活性高且易被人類或其他生物吸收利用，所以有機硒常被視為高效且安全的補硒制劑[2]。在微藻培養(yǎng)基中添加適量亞硒酸鈉[3-4]以實現(xiàn)微藻對硒的生物富集和轉化，是獲取有機硒化合物簡便而有效的途徑之一[5]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微型藻類是硒的主要吸收者，它們積累無機硒，然后轉化成有機硒，再通過食物鏈將硒轉移到高等生物體內(如輪蟲、橈足類、枝角類和魚類等)[6]。因此，微藻硒積累和硒的有機化過程已成為當前微藻富硒研究的重要方向。

微藻對硒的生物轉化主要是合成硒蛋白、硒多糖等生物大分子[7-9]，其中含硒的酶類如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等對哺乳動物具有重要的生理意義，是阻斷人體內自由基反應、清除有毒產物過氧化脂質的重要物質[5]。在高等植物代謝和環(huán)境脅迫的過程中也產生大量的游離自由基，這些自由基可被超氧化物歧化酶(SOD)等相應酶系統(tǒng)清除，亦可被GSH-Px清除。目前研究報道的富硒微藻有鈍頂螺旋藻Spirulinaplatensis[10-11]、鹽藻Dunaliellasalina[12]、紫球藻Porphyridiumsp.[13]、柵藻Scenedesmusquadricauda[14]和小球藻Chlorellasp.[15-19]等，這些研究表明，硒對微藻的生長和抗氧化系統(tǒng)的發(fā)生均具有促進和抑制的雙重效應，需要合理地控制硒添加濃度。

蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa是綠藻門綠藻綱綠球藻目小球藻科小球藻屬的單細胞藻類，其藻體富含蛋白質、不飽和脂肪酸、活性代謝物、生物多糖、維生素和微量元素等多種營養(yǎng)成分[20]。因其繁殖速度快、分布廣泛、易于培養(yǎng)，蛋白核小球藻已成為當前常用的試驗材料和水產餌料微藻。已有學者證明,硒強化小球藻對養(yǎng)殖動物的生長及免疫活性有很好的促進作用[21-22]。低濃度硒有助于正常細胞的生長和谷胱甘肽過氧化物酶功能的發(fā)揮，高濃度硒是有毒的，會導致活性氧ROS的產生，從而導致DNA氧化、DNA雙鏈斷裂和細胞死亡[2]。目前，有關亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長及抗氧化酶活性的研究較少，且適宜硒濃度及富硒量的研究結果差異較大。為此，本試驗中通過研究不同質量濃度亞硒酸鈉對蛋白小球藻生長及抗氧化酶活性的影響，來確定蛋白核小球藻富集亞硒酸鈉的最佳濃度和培養(yǎng)時間，旨在闡明蛋白核小球藻對硒有機化過程的機制，也為富硒小球藻的開發(fā)提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蛋白核小球藻藻種購自中國科學院武漢水生生物研究所，藻種編號為 FACHB-5。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng) 稱取40 mg Na2SeO3溶于40 mL超純水，配制l g/L的亞硒酸鈉貯備液，通過貯備液稀釋的方法設置不同質量濃度(0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/L)的含亞硒酸鈉的BG11(pH 7.0)培養(yǎng)基。在250 mL錐形瓶中加入100 mL培養(yǎng)基，于滅菌鍋中進行121 ℃高壓滅菌30 min。在超凈操作臺中提取處于指數增長期的蛋白核小球藻接種到不同硒濃度的培養(yǎng)基中，接種后藻細胞初始濃度均為1×106cells/mL，置于人工光照培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)條件溫度為25 ℃，光照強度為25 μmol/(m2·s)，光周期中光暗比(L∶D)為12 h∶12 h，每天早、中、晚各搖動1次。每組設置3個平行，培養(yǎng)周期為13 d。每隔1天取樣1次。采樣結束后繼續(xù)觀察30 d，查看各組試驗藻是否出現(xiàn)紅硒化現(xiàn)象。

1.2.2 藻密度及生長速率的測定 使用血球計數器，在顯微鏡下計算藻密度。使用紫外可見分光光度計在波長為 685 nm下測定藻OD值，其相對生長速率(RGR)計算公式[17]為

RGR=ln(Nt/N0)/t。

其中：N0為藻初始 OD 值；Nt為培養(yǎng)第t天后的藻 OD值。

1.2.3 富硒普通小球藻硒含量的測定 分別在第7天和第13天取樣10 mL，將所有處理組藻液移至 14 mL離心管內，以6 000 r/min離心12 min，去上清，再用超純水洗滌離心收集藻濃縮液，經真空冷凍干燥，獲得藻粉。用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP) 測定藻體的含硒量[23]。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 將試驗培養(yǎng)的蛋白小球藻以5 000 r/min離心10 min，棄上清。用去離子水反復沖洗藻沉淀，直到藻體外附著的培養(yǎng)基完全沖洗干凈。將微藻沉淀置于預冷的PBS 緩沖液(pH 7.0)中，在冰上超聲破碎(9 min)，混合勻漿以10 000 r/min離心 30 min，取上清測定酶活性。使用 BCA法測定上清中總蛋白濃度。小球藻中SOD和GSH-Px活性測定均嚴格按照生物試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定。

1.3 數據處理

試驗數據均以平均值±標準差 (mean±S.D.) 表示，采用 SPSS 20.0 軟件對試驗結果進行單因素方差分析 (ANOVA)，顯著性水平設為 0.05。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長的影響

從圖1可見：不同質量濃度的亞硒酸鈉對小球藻生長影響不同；第9天后，2、4 mg/L亞硒酸鈉對小球藻的生長有顯著促進作用(P<0.05)，6 mg/L及以上亞硒酸鈉對小球藻生長具有顯著抑制作用(P<0.05)，尤其8～100 mg/L質量濃度組在試驗前9 d內幾乎停止生長，但第9天后藻細胞數明顯增加。

從圖2可見，第30天時100 mg/L處理組藻液開始變紅,第33天時80 mg/L處理組藻液開始變紅，第37天時60 mg/L處理組藻液開始變紅，而10、20、40 mg/L處理組在43 d的觀察期內為未變紅。可見，在高硒環(huán)境中，大量紅色元素硒從藻體中析出，導致培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。

從表1可見：試驗前7 d，2、4 mg/L處理組藻細胞相對生長速率與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，其他質量濃度組顯著高于對照組(P<0.05)；試驗第9天時，6～10 mg/L處理組小球藻生長速率顯著低于對照組(P<0.05)，第13天時生長速率與對照無顯著性差異(P>0.05)；20～100 mg/L處理組在試驗前9 d內為負生長，第9天后恢復生長，且生長速率顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 不同亞硒酸鈉質量濃度對蛋白核小球藻細胞相對生長速率的影響Tab.1 Effects of different concentrations of sodium selenite on relative growth rate of green alga Chlorella pyrenoidosa

2.2 蛋白核小球藻中硒的生物轉化

從圖3可見：亞硒酸鈉質量濃度在2～100 mg/L范圍內，蛋白核小球藻細胞含硒量隨亞硒酸鈉質量濃度的增加而增加；第7天時,2、4 mg/L處理組藻細胞含硒量顯著高于對照組(P<0.05)；第13天時，80、100 mg/L處理組藻細胞含硒量顯著高于其他質量濃度組及對照組(P<0.05)，6～60 mg/L處理組藻細胞含硒量又顯著高于2～4 mg/L處理組(P<0.05)。

2.3 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻抗氧化酶活性影響

從圖4可見：試驗第7天時，2、4 mg/L亞硒酸鈉處理組小球藻細胞SOD酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；第13天時，小球藻細胞SOD酶活性總體上隨亞硒酸鈉質量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，2～20 mg/L處理組酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，其中10～20 mg/L組酶活性最高，顯著高于其他處理組(P<0.05)，100 mg/L處理組酶活性最低(P<0.05)。

從圖5可見：第7天時，2、4 mg/L亞硒酸鈉處理組小球藻細胞GSH-Px酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，其中，4 mg/L處理組酶活性最高(P<0.05)；第13天時，小球藻細胞GSH-Px酶活性總體上隨亞硒酸鈉質量濃度的增加呈先降低后升高的變化趨勢，20～100 mg/L亞硒酸鈉處理組小球藻細胞GSH-Px酶活性顯著高于其他處理組(P<0.05)，2、4 mg/L處理組GSH-Px酶活性與對照組無顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于8～10 mg/L處理組(P<0.05)。

2.4 亞硒酸鈉對小球藻細胞形態(tài)和分裂方式的影響

因蛋白核小球藻呈圓球狀，參照Park等[24]的方法，用細胞直徑表示細胞體積大小，按細胞直徑(D)將藻細胞體積大小分為3個規(guī)格：2 μm

3 討論

3.1 蛋白核小球藻對硒的富集

硒對微藻具有生長促進與毒性抑制雙重性，微藻的富硒量與添加的硒質量濃度不成正比。添加硒質量濃度較低時，微藻富集硒的能力隨硒質量濃度升高而增大；添加硒質量濃度較高時，微藻富集硒的能力隨硒質量濃度升高而降低。本研究中在低硒質量濃度范圍內，小球藻富硒能力逐漸增加，與呂蓉等[15]、Zhong等[25]及肖俊超等[26]研究結果一致,硒質量濃度≥6 mg/L時，小球藻幾乎不生長甚至死亡，對硒沒有富集能力，但恢復生長后藻細胞含硒量隨硒質量濃度的升高而增加，這可能是小球藻適應高硒環(huán)境后富硒能力增強的結果，此現(xiàn)象在其他富硒藻類研究中均未出現(xiàn)，其原因有待進一步探究。因此，實際生產中對初始密度為1×106cells/mL的小球藻進行富硒培養(yǎng)時，添加亞硒酸鈉的質量濃度最好控制在4 mg/L以內。

3.2 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長的影響

目前有關硒對小球藻生長影響的研究結果差異較大。不同研究者采用的藻種不同，培養(yǎng)條件、藻種初始密度、硒添加時間不同時，所報道的小球藻生長適宜硒濃度和抑制硒濃度值也不同，而對于相同藻種，培養(yǎng)條件不同時結果也不盡相同(表2)。本研究中亞硒酸鈉質量濃度為2～4 mg/L時對小球藻生長具有促進作用，硒質量濃度為6 mg/L及以上時則具有抑制作用，說明6 mg/L亞硒酸鈉已達到脅迫濃度。Zhao等[27]發(fā)現(xiàn)，小球藻初始密度為1×106cells/mL，添加硒質量濃度為2 mg/L時藻細胞數量最多，比對照組高出13%，硒質量濃度為5 mg/L及以上時對蛋白核小球藻生長具有抑制作用，這與本研究結果相似。Zhong等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻初始密度為6×107cells/mL，添加40 mg/L亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長具有促進作用，硒質量濃度為60 mg/L及以上時則抑制藻類生長。許歡歡等[23]研究發(fā)現(xiàn)，0～100 mg/L硒質量濃度變化未引起小球藻生長的顯著差異。Zhong等[25]研究結果與本研究不同，可能是其試驗中初始藻細胞密度較高的原因，而許歡歡等[23]的研究可能是其培養(yǎng)光照時間較長(光暗周期L∶D=16 h∶8 h)促進了小球藻細胞分裂的原因。

表2 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長與富硒量的影響(均為一次加硒)

本研究中，亞硒酸鈉質量濃度為20～100 mg/L時，試驗前期小球藻細胞生長速率為負值，這說明產生了嚴重毒性作用，引起大量藻細胞死亡。Zhao等[27]研究得出，亞硒酸鈉對蛋白核小球藻細胞的致死質量濃度為15.37 mg/L。這可能是本研究中在硒質量濃度為20 mg/L及以上的環(huán)境下小球藻出現(xiàn)死亡的原因。但這些藻細胞并未全部死亡，而是有一小部分存活下來，且在第9天時開始生長速率為正值。Umysová等[1]研究硒化合物對柵藻的毒性作用時也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，不同的是其試驗中存活下來的柵藻藻細胞未分裂，而本研究中存活下來的小球藻恢復細胞分裂，其中，較低質量濃度組生長速率接近對照組，這也印證了小球藻對硒耐受性較高的特點[28]。

楊芳[29]研究發(fā)現(xiàn)，硒濃度概念不能很好地反映硒的生物效應，引入“硒劑量”的概念(即單位藻細胞上所承受的硒量)能更準確地表達硒對螺旋藻細胞生長的影響。小球藻細胞密度較低條件下富硒培養(yǎng)時，加入一定濃度的硒，每個藻細胞可能承受較大劑量的硒，此時硒對小球藻的生長不利；而小球藻細胞密度較高時，加入相同濃度的硒，每個藻細胞所承受的硒劑量則較小，硒對小球藻的生長可能無害。因此，不同初始密度的小球藻培養(yǎng)液中添加相同濃度的硒，每個藻細胞所承受的硒劑量不相同，對小球藻的影響可能就大相徑庭。如在本研究小球藻初始密度提高10倍的藻培養(yǎng)液中添加相同濃度的亞硒酸鈉，結果顯示，該處理對小球藻生長并無顯著性影響(數據未列出)。藻密度的不同是引起硒脅迫強度變化的主要因素[11]，因此，研究硒對小球藻生長及生理生化指標的影響時，應以單位藻細胞上所承受的硒量來探討。

3.3 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻抗氧化酶活性的影響

當處理條件為低硒脅迫濃度和短時間時，SOD酶活性受誘導而升高，這是植物本身的一種防御反應，可認為是植物在輕度脅迫下的鍛煉效應。但這種保護反應是有限的，隨著處理時間的延長和硒脅迫濃度的增加，保護酶的活性受到抑制而下降。培養(yǎng)后期氮、磷等主要無機鹽消耗殆盡，可能會抑制新的抗氧化酶的合成，已合成的抗氧化酶不斷分解，最終導致抗氧化酶活性下降[5]，這可能是本試驗中第13天時SOD活性比第7天時降低的原因。李亞男等[12]在研究硒對鹽藻生長及抗氧化酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，SOD活性對低硒濃度無響應，但當亞硒酸鈉質量濃度超過10 mg/L時，其活性明顯提高。肖俊超等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，當硒脅迫質量濃度達到一定量(20 mg/L)時，才能誘導普通小球藻SOD酶活性顯著增大。而本研究結果表明，低質量濃度(2～4 mg/L)亞硒酸鈉就能夠誘導蛋白核小球藻SOD活性顯著增加。Zhao等[27]也發(fā)現(xiàn)類似結果，這說明不同藻類SOD活性對硒處理的響應不同。

本試驗中，在試驗第13天時，高硒質量濃度處理組 GSH-Px酶活性顯著高于低硒質量濃度組和對照組，可能是高硒質量濃度組中硒參與合成的硒蛋白協(xié)助小球藻細胞對抗氧化逆境，如GSH-Px通過催化過氧化物被降解過程，保持細胞持續(xù)健康。另外，GSH-Px活性的變化與藻體中的硒含量并無較大聯(lián)系[30]，而是與硒脅迫強度密切相關，硒脅迫強度越大，GSH-Px活性越高。陳思嘉等[11]指出，在較高的硒脅迫強度下，藻體主要是靠強化GSH-Px的活性來抵抗由硒引起的氧化脅迫，細胞中的H2O2主要由GSH清除。說明第13天時亞硒酸鈉濃度≥20 mg/L的處理對小球藻的脅迫強度大于10 mg/L以內的處理。

3.4 亞硒酸鈉對蛋白核小球藻的毒性

本研究中未添加亞硒酸鈉的小球藻細胞分裂方式為典型的二分裂[32]，大部分直徑小于4 μm。而20 mg/L及以上亞硒酸鈉處理組小球藻細胞有不同于二分裂的分裂方式，細胞體積明顯增加，出現(xiàn)的細胞團體積隨亞硒酸鈉質量濃度的增加而增大。有研究表明，亞硒酸鹽細胞毒性對葉綠體、基質、類囊體和淀粉核均有影響，且在較高質量濃度下，淀粉顆粒和含硒電子致密顆粒的數量和體積均有所增加[33]。這可能是本研究中較高質量濃度硒處理下藻細胞體積變大的原因。四尾柵藻暴露于100 mg/L亞硒酸鹽處理下，其細胞畸形、葉綠體漂白、刺數目和位置異常[1]。因此，本試驗中出現(xiàn)的細胞團，也可能是小球藻在高硒環(huán)境中的一種異常表現(xiàn)。硒對植物的毒性一般歸因于硒可以不加區(qū)別地替代硫元素，并將硒氨基酸合并到蛋白質中[34]。本研究中小球藻細胞異常的分裂方式，可能跟硒誘導的核酸變化與酶活性的相互關系有關，尤其是硫氧還蛋白還原酶，這種廣泛分布的黃素酶提供還原性硫氧還蛋白，一種二硫醇氫供體，用于還原二硫蛋白，并將核糖核酸還原為脫氧核糖核酸，這是DNA合成的第一個獨特步驟[34]。

鄭建仙[35]研究酵母對硒的生物富集與轉化時發(fā)現(xiàn)紅硒化現(xiàn)象，表現(xiàn)為培養(yǎng)液中出現(xiàn)紅色沉淀，即酵母細胞將毒性較大的亞硒酸鈉還原成無毒的元素硒。孫顯[31]也發(fā)現(xiàn)，普通小球藻在高硒環(huán)境中也會有大量紅色元素硒從藻體析出。本試驗中小球藻在硒處理1個月之后，高質量濃度硒處理組最先有大量紅色元素硒從藻體中析出。因此，在生產實踐中應合理控制硒添加質量濃度及富硒培養(yǎng)時間，盡可能減少紅硒現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結論

1)低質量濃度(2～4 mg/L)的亞硒酸鈉對蛋白核小球藻生長呈顯著促進作用，高質量濃度(6～100 mg/L)的亞硒酸鈉呈現(xiàn)顯著抑制作用。

2)添加不同質量濃度的亞硒酸鈉處理時蛋白核小球藻的SOD 酶活性與GSH-Px酶活性的表現(xiàn)不同。

3)高硒質量濃度處理組蛋白核小球藻在試驗中期恢復生長，到試驗末期生長速率明顯增加。

總之，蛋白核小球藻富硒培養(yǎng)時不可添加過多亞硒酸鈉，應控制硒添加質量濃度及富硒培養(yǎng)時間，以免出現(xiàn)藻體中毒死亡現(xiàn)象。