李鐵梁，邢薇，徐冠玲，馬志宏，姜娜，郁歡歡，羅琳

(北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

錦鯉Cyprinuscarpiovar.koi是深受人們喜愛的一種名貴觀賞魚。2000年以來(lái)，中國(guó)錦鯉養(yǎng)殖逐漸形成產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化，與此同時(shí)，疾病頻發(fā)成為限制其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。以錦鯉養(yǎng)殖中最常見的腸道疾病為例，腸炎會(huì)引起錦鯉脫離群體游動(dòng)、體色發(fā)暗、食欲下降，進(jìn)而影響錦鯉觀賞價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引發(fā)其他并發(fā)癥進(jìn)而導(dǎo)致魚體死亡[1]。傳統(tǒng)上，在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中主要使用抗生素[2]，但抗生素濫用可引起環(huán)境問(wèn)題，同時(shí)也會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群紊亂失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致免疫力下降，故抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中正逐漸被禁止使用[3]，或通過(guò)在飼料中添加具有免疫促進(jìn)功能的添加劑進(jìn)行替代[4-5]。

棉子糖是一種具有較強(qiáng)增殖雙歧桿菌作用的功能性低聚糖，能促進(jìn)腸道雙歧桿菌、乳酸菌的增殖，降低致病性鏈球菌的數(shù)量。研究證實(shí)，在魚用飼料中添加棉子糖具有促進(jìn)免疫、降低腸道疾病發(fā)生的作用[2, 6-8]。目前，尚未見棉子糖應(yīng)用于觀賞魚飼料的研究報(bào)道。觀賞魚與食用魚飼養(yǎng)目的不同，影響其市場(chǎng)價(jià)值的主要是體色、形體和健康等觀賞品質(zhì)[9]，因此，其配合飼料的配制中除了需要關(guān)注營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之外，還需關(guān)注飼料對(duì)觀賞品質(zhì)的影響。中國(guó)魚用飼料側(cè)重食用魚飼料開發(fā)，其質(zhì)量和價(jià)格均具有較強(qiáng)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，而觀賞魚飼料的研發(fā)主要借鑒食用魚飼料的研究結(jié)果，導(dǎo)致飼料的增色、增體、塑形等功能與效果缺少國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。筆者在研究比較國(guó)內(nèi)外觀賞魚飼料養(yǎng)殖錦鯉時(shí)發(fā)現(xiàn)，與日本產(chǎn)錦鯉飼料相比，國(guó)產(chǎn)觀賞魚飼料在營(yíng)養(yǎng)配方精準(zhǔn)度、功能性研究等方面亟待提高。

本試驗(yàn)中以錦鯉為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合理水平的棉子糖進(jìn)行飼料添加，并評(píng)價(jià)其對(duì)錦鯉腸道健康、非特異免疫、生長(zhǎng)性能及觀賞品質(zhì)的影響，以期為棉子糖在錦鯉飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用錦鯉由北京賢雅聚悅生態(tài)農(nóng)業(yè)園提供，鏡檢無(wú)寄生蟲、攝食正常、游動(dòng)活潑。在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水族系統(tǒng)中飼養(yǎng)，以商品飼料馴化2周后用于養(yǎng)殖試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的制備 以魚粉、豆粕、菜粕、谷朊粉為主要蛋白源，以大豆油為脂肪源，添加不同比例的棉子糖配制試驗(yàn)飼料?；A(chǔ)飼料原料組分為：豆粕30%、面粉20%、菜粕15%、魚粉15%、谷朊粉5.4%、大豆油3%、預(yù)混料1.3%、氧化膽堿0.3%和玉米粉10%。其中，每千克預(yù)混料(mg/kg飼料)含VA 20、VB110、VB215、VB615、VB128、煙酸胺100、泛酸鈣40、生物素2、肌醇200、葉酸10、VE 400、VK320、VD 310、硫酸亞鐵FeSO4·7H2O 981.2、硫酸鋅ZnSO4·7H2O 320.7、硫酸錳MnSO4·H2O 80、碘化鉀KI 80、亞硒酸鈉Na2SeO3(10%) 67、氯化鈷CoCl2· 6H2O 0.5、氯化鈉NaCl 100、硫酸鎂MgSO42 000、磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)25 000、糊精 3 520.6。試驗(yàn)用原料魚粉、豆粕、谷朊粉等均由北京三友創(chuàng)美飼料科技有限公司提供。

在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%(CK組)、0.06%(T1組)、0.10%(T2組) 的棉子糖，用玉米粉調(diào)平，配制成等氮(5.2%)、等脂肪(6.0%)的3組試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)用棉子糖由北京中唐瑞德生物技術(shù)有限公司提供，其對(duì)一般大宗養(yǎng)殖淡水魚類的棉子糖推薦添加量為0.06%，而對(duì)鱘、鮭鱒類等冷水魚類的推薦添加量為0.10%。目前，由于針對(duì)食用魚的推薦劑量未考慮到觀賞魚對(duì)觀賞品質(zhì)的特殊要求，且本試驗(yàn)為棉子糖在觀賞魚上的首次應(yīng)用，故設(shè)計(jì)0.06%、0.10%兩個(gè)添加量進(jìn)行試驗(yàn)。

將所有飼料原料粉碎后過(guò)0.246 mm篩，各原料充分混合均勻后，用飼料膨化機(jī)(MY56X2A, 牧羊集團(tuán)，江蘇)制成粒徑為2.0 mm的膨化飼料，陰干后用雙層塑料袋包裝后貯存于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料的組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)組成

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將暫養(yǎng)的試驗(yàn)魚停食饑餓24 h后，選取初始體質(zhì)量為(42.34±0.52)g的錦鯉270尾，隨機(jī)分成CK(對(duì)照組)、T1、T2共3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。

試驗(yàn)地點(diǎn)為北京賢雅聚悅生態(tài)農(nóng)業(yè)園。試驗(yàn)開始時(shí)，隨機(jī)分配試驗(yàn)魚至9個(gè)串聯(lián)的循環(huán)過(guò)濾養(yǎng)殖池(2.0 m×1.2 m×1.5 m水泥池)中，每個(gè)池中放入30尾試驗(yàn)魚，每個(gè)過(guò)濾的養(yǎng)殖池平均貯水3 m3，養(yǎng)殖池設(shè)有上、下2個(gè)出水口和1個(gè)進(jìn)水口，并設(shè)有曝氣裝置，24 h充氧曝氣。養(yǎng)殖池采用自然光照射，光照充足。

試驗(yàn)魚每天投喂4次(8:00、11:00、14:00和17:00)，每種配合飼料投喂3個(gè)養(yǎng)殖池。每次投喂量以15 min內(nèi)攝食完畢、飽食無(wú)剩料為原則，并統(tǒng)計(jì)投喂飼料量。投喂試驗(yàn)持續(xù)70 d。試驗(yàn)期間，每2周調(diào)換養(yǎng)殖池，并稱取試驗(yàn)魚體質(zhì)量，同時(shí)進(jìn)行水體溶氧、氨氮、pH、亞硝酸鹽等水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖池水溫為(22.33±1.35)℃，溶氧為(8.83±0.58)mg/L，pH為8.26±0.08，氨氮為(0.05±0.01)mg/L，亞硝酸鹽為(0.004±0.001)mg/L。

1.2.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1) 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，對(duì)每組試驗(yàn)魚計(jì)數(shù)并用500 mg/L三氯叔丁醇進(jìn)行麻醉，逐尾稱重、測(cè)量體長(zhǎng)，并計(jì)算存活率(SR)、增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)、攝食率(FR)等指標(biāo)，各生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式為

SR=nt/n0×100%，

WGR=(Wt-W0)/W0×100%，

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

FCR=F/(Wt+Wd-W0)×100%，

FR=2F/[(W0+Wt+Wd)/t]×100%。

其中：nt、n0分別為試驗(yàn)終末和試驗(yàn)初始魚的數(shù)量(ind.)；Wt、W0分別為試驗(yàn)終末和試驗(yàn)初始魚體總質(zhì)量(g)；Wd為死亡魚體總質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；F為攝食量(g)。

2)非特異免疫指標(biāo)的測(cè)定。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，從每個(gè)處理組隨機(jī)取9尾魚，在冰盤中用2 mL無(wú)菌注射器從試驗(yàn)魚尾靜脈采集血液并置于真空采血管中，獲得的靜脈血于4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，獲得的血清保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、補(bǔ)體C3、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、溶菌酶(LZM)、 谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等指標(biāo)的檢測(cè)。

3) 觀賞性指標(biāo)的測(cè)定。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，對(duì)每尾試驗(yàn)魚進(jìn)行麻醉，逐條測(cè)量并計(jì)算魚體表亮度和肥滿度(CF)。體表亮度的測(cè)定參考冷向軍等[11]的方法，先用吸水紙將魚體表面的水分吸干，再將分光測(cè)色儀(CM-600D，美能達(dá))探頭緊貼魚體側(cè)最寬處側(cè)線以上，測(cè)量魚體表亮度(L*)。

飼喂試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，從每個(gè)處理組隨機(jī)取9尾魚，用于全魚脂肪和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

解剖采集血液后的樣品魚，剪開每尾樣品魚的腹腔，取出肝臟組織稱重并計(jì)算臟體指數(shù)(VSI)。計(jì)算公式為

CF=W/L3×100，

VSI=WI/W×100%。

其中：WI為內(nèi)臟質(zhì)量(g)；W為魚體質(zhì)量(g)；L為魚體長(zhǎng)(cm)。

1.2.4 腸道形態(tài)及結(jié)構(gòu)觀察 解剖采集血液后的樣品魚，取出腸組織，在其固定位置切取0.5 cm×0.5 cm腸道2塊，用生理鹽水沖洗黏膜表面，經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)清洗3～4次，立即置于2.5%戊二醛溶液中固定12 h，用梯度酒精脫水，乙酸異戊酯置換，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，噴金后于掃描電子顯微鏡(HITACHI S-4800型)下觀察并拍照。

另制作透射電鏡切片，對(duì)皺褶高度和寬度，以及微絨毛高度和密度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5 腸道微生物菌群 解剖采集血液后的樣品魚，取全腸及內(nèi)容物置于自封袋內(nèi)，保存于-80 ℃下用于腸道微生物菌群的檢測(cè)。之后將保存的腸道樣本混勻后取0.2 mg，用Bacterial DNA Kit 試劑盒(Omega, 美國(guó))提取腸道細(xì)菌總DNA。以提取的腸道微生物基因組DNA為模板，16S rRNA V3-V4區(qū)特異性引物(B341F：5′CCTACGGGNGGCWGCAG 3′； B785R：5′GACTACHVGGGTATCTAATCC 3′)擴(kuò)增序列[11]。PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：DNA模板2.5 μL，2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，50 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取電泳圖譜條帶為400～450 bp的樣品進(jìn)行膠回收。委托北京源宜基因科技股份有限公司進(jìn)行基于Illumina MiSeq技術(shù)測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建文庫(kù)，進(jìn)行高通量雙末端測(cè)序。

Illumina MiSeq測(cè)序所得原始序列用FLASH軟件拼接，之后用QIIME軟件過(guò)濾拼接后的序列，并將過(guò)濾后的片段與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并使用USEARCH 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類的操作，將有效序列按序列相似度97%聚類成分類單元(Operational taxonomic units，OUT)。使用RDP 分類器注釋分類信息，分類基于Bergey’s taxonomy，共分為6 級(jí)，依次為界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)，默認(rèn)閾值為80%，低于此值則為unclassified。

最后使用QIIME軟件, 做Alpha 多樣性指數(shù)的稀釋曲線, 分別利用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌生態(tài)多樣性指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉子糖對(duì)錦鯉腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)中對(duì)3種試驗(yàn)飼料投喂的錦鯉腸道進(jìn)行了掃描電鏡觀察。從圖1可見：對(duì)照組的腸壁皺褶較為平整，凹凸豐富度小于T1、T2組，T1組腸壁皺褶凹凸豐富、內(nèi)部非常光滑，T2組腸壁皺褶凹凸豐富，內(nèi)部較為光滑，其光滑程度介于對(duì)照組與T1組之間；對(duì)照組的腸壁皺褶間食糜顆粒較多，微絨毛上黏附著大量的食糜顆粒直至皺褶內(nèi)部，且有明顯的條狀黏滯性物質(zhì)，幾乎覆蓋了皺褶內(nèi)部，而試驗(yàn)組皺襞間食糜顆粒較對(duì)照組小，數(shù)量少，無(wú)條帶狀黏滯性物質(zhì)；T1組腸壁皺褶間食糜顆粒較少，食糜顆粒以微小殘留為主，內(nèi)部皺褶凹陷處無(wú)大的異物殘留，腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛上黏附的食糜顆粒較少；T2組皺褶間食糜顆粒較少，且較小，內(nèi)部皺褶凹陷處有少量較大的食糜顆粒，腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛上黏附食糜顆粒較少、較小。

2.2 棉子糖對(duì)錦鯉腸道顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的影響

由表2可知，試驗(yàn)魚腸道的皺褶高度、寬度和微絨毛高度在3個(gè)處理組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但3組間的腸道微絨毛密度存在顯著性差異(P<0.05)，T1、T2組的微絨毛密度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但此兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 飼料棉子糖水平對(duì)錦鯉腸道皺褶和微絨毛的影響

2.3 棉子糖對(duì)錦鯉腸道細(xì)菌菌群多樣性的影響

根據(jù)OTUs代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)注釋文件對(duì)比，在97%(種)水平上進(jìn)行OTUs劃分，覆蓋率(good’s coverage)指數(shù)反映了測(cè)序的深度，指數(shù)均在0.999 以上(表3), 說(shuō)明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。對(duì)3組試驗(yàn)魚的腸道微生物多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T1、T2組的Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P=0.042)，但T1、T2組的Simpson指數(shù)則顯著低于對(duì)照組(P=0.017)(表3)。這說(shuō)明飼料中棉子糖的添加有效提高了錦鯉腸道微生物多樣性。

表3 飼料棉子糖水平對(duì)錦鯉腸道細(xì)菌多樣性的影響Tab.3 Intestinal bacterial diversity of koi carp Cyprinus carpio var.koi fed the diets containing different contents of raffinose

2.4 棉子糖對(duì)錦鯉免疫性能和抗氧化能力的影響

從表4可見，飼料中添加棉子糖對(duì)錦鯉血清補(bǔ)體C3、LZM、MPO、MDA、GSH、GSH-Px和CAT水平均無(wú)顯著性影響(P>0.05)，但T1、T2組的SOD水平則顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而此兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 飼料棉子糖水平對(duì)錦鯉免疫及抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 棉子糖對(duì)錦鯉魚生長(zhǎng)性能與觀賞品質(zhì)的影響

從表5可見：經(jīng)3種飼料飼喂70 d后,3組錦鯉的存活率均在93%以上，且組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；T1、T2組錦鯉的增重率、特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，T1組的飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，T2組則與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；3種試驗(yàn)飼料對(duì)錦鯉的攝食率、全魚蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著性影響(P>0.05)；T1、T2組的全魚脂肪含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)一步比較試驗(yàn)組的生長(zhǎng)性能發(fā)現(xiàn)， T1組的錦鯉增重率、特定生長(zhǎng)率顯著高于T2組(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著低于T2組(P<0.05)。

錦鯉的體表色澤與體型是其重要的觀賞品質(zhì)。本研究中以體表亮度L*值表征體表光澤，以肥滿度、臟體指數(shù)、全魚脂肪含量分別表征其體型。從表5可見：3組試驗(yàn)飼料對(duì)錦鯉的體表亮度L*值和全魚脂肪含量有顯著性影響(P<0.05)，對(duì)臟體指數(shù)和肥滿度無(wú)顯著性影響(P>0.05)；L*值在T1組最高，T2組最低，且T1組的L*值顯著高于T2組(P<0.05)，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；各組全魚脂肪含量為CK>T1>T2，其中，T1、T2組的全魚脂肪含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，T1、T2組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表5 飼料棉子糖水平對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能與觀賞品質(zhì)的影響(70 d)

3 討論

3.1 棉子糖的腸道屏障保護(hù)作用與錦鯉健康

腸道是動(dòng)物機(jī)體與外界環(huán)境密切接觸的部分，同時(shí)又是部分腸免疫細(xì)胞發(fā)育分化的微環(huán)境。因此，腸道除了作為消化吸收的重要場(chǎng)所外，也發(fā)揮著機(jī)體免疫防御與免疫耐受的重要作用。正常的腸黏膜是通過(guò)機(jī)械屏障、免疫屏障及微生態(tài)屏障共同維持腸道微生態(tài)平衡，抵御病原菌的入侵[12]。因此，醫(yī)學(xué)上認(rèn)為，腸道屏障功能的改變與代謝類、消化類、免疫類等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。棉子糖作為一種益生元，在進(jìn)入動(dòng)物消化道后不被消化道前段酶消化，而選擇性地刺激消化道后端的有益菌生長(zhǎng)及其活性，比如被寄生于該區(qū)域的雙歧桿菌、乳酸桿菌等選擇性作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，進(jìn)而促使有益菌群大量繁殖、菌群多樣性增加，有利于維護(hù)腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡[13]。

本試驗(yàn)中，錦鯉血清的補(bǔ)體C3、LZM、MPO、MDA等非特異免疫指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，這與以往研究中棉子糖具有免疫促進(jìn)功能的結(jié)論不同。葛紅云等[2]發(fā)現(xiàn)，雖然棉子糖對(duì)花鱸非特異免疫指標(biāo)無(wú)顯著性影響，但以嗜水氣單胞菌攻擊花鱸時(shí)，棉子糖能顯著提高花鱸存活率。這可能是因?yàn)樵诨A(chǔ)飼料和飼養(yǎng)條件均滿足供試魚生長(zhǎng)需求的條件下，魚類機(jī)體處于免疫穩(wěn)態(tài)，只有在受病原菌攻擊時(shí)，棉子糖對(duì)機(jī)體的免疫促進(jìn)作用才能體現(xiàn)出來(lái)。這意味著棉子糖對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫促進(jìn)作用可能是通過(guò)提高抗應(yīng)激能力實(shí)現(xiàn)的。

另外，在本試驗(yàn)飼料中添加棉子糖后，錦鯉血清SOD水平顯著高于對(duì)照組，同時(shí)，腸道細(xì)菌多樣性顯著增加，證實(shí)了棉子糖對(duì)錦鯉腸道免疫屏障與微生態(tài)屏障的保護(hù)作用。這將進(jìn)一步增加棉子糖保護(hù)水生動(dòng)物腸道免疫屏障的科學(xué)依據(jù)，也為魚類疾病防控提供新的思路。

3.2 棉子糖的腸道營(yíng)養(yǎng)作用與錦鯉的消化吸收、生長(zhǎng)性能

錦鯉屬于無(wú)胃魚，腸道是其消化吸收的主要場(chǎng)所，因而其腸道發(fā)育及腸內(nèi)環(huán)境狀況決定著對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收利用程度。棉子糖等非消化寡糖對(duì)腸道具有多種作用與功能，其發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸[14]，短鏈脂肪酸是腸道黏膜代謝的主要能源，對(duì)促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖具有重要作用[15]，易中華等[16]證實(shí)，棉子糖等非消化寡糖能直接影響動(dòng)物腸道黏膜的結(jié)構(gòu)和功能。在對(duì)草魚[17]和尼羅羅非魚[18]的研究中也有寡糖可以促進(jìn)魚類腸道微絨毛增長(zhǎng)的報(bào)道。腸道微絨毛表面分泌有雙糖酶和多肽酶，能催化碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝[19]，是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝的重要場(chǎng)所。因此，腸道微絨毛的增加意味著魚類腸道吸收面積增加，有利于其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗(yàn)中電鏡觀察顯示，在飼料中添加棉子糖后，錦鯉的腸微絨毛密度顯著增加，且腸壁皺褶間食糜顆粒比對(duì)照組少，內(nèi)部皺褶凹陷處無(wú)大的異物殘留，食糜顆粒以微小殘留為主，這說(shuō)明棉子糖促進(jìn)了錦鯉對(duì)飼料物質(zhì)的消化吸收。

本試驗(yàn)中選擇的棉子糖屬于功能性低聚糖，除具有改善動(dòng)物腸道和消化功能外，以往報(bào)道還認(rèn)為其具有促生長(zhǎng)作用。邱燕等[17]報(bào)道，在魚用的基礎(chǔ)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001 2%的棉子糖，草魚特定生長(zhǎng)率提高27.40%。本試驗(yàn)中，棉子糖的添加顯著提高了錦鯉的增重率和特定生長(zhǎng)率，再次證實(shí)了棉子糖對(duì)水生動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用。但該作用是促進(jìn)攝食還是促進(jìn)對(duì)有限營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最大化利用，至今尚無(wú)報(bào)道。本研究中將基礎(chǔ)飼料對(duì)照組及分別添加0.06%和0.10%棉子糖的飼料組進(jìn)行比較后，未發(fā)現(xiàn)在錦鯉攝食率上的顯著性差異。這說(shuō)明棉子糖可能并無(wú)促進(jìn)攝食的作用，而是通過(guò)促進(jìn)對(duì)有限營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最大化利用促進(jìn)錦鯉生長(zhǎng)。

棉子糖具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，在腸道中經(jīng)菌群發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量氣體，能引發(fā)消化不良、腹瀉等，故棉子糖的促生長(zhǎng)作用是有限的，其添加比例在適宜范圍內(nèi)會(huì)促進(jìn)魚類生長(zhǎng)，添加過(guò)量則影響魚類攝食和生長(zhǎng)[7, 20]。葛紅云等[2]研究報(bào)道，花鱸飼料中添加棉子糖的適宜比例是0.000 8%～0.002%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。本研究中棉子糖的添加量為0.10%時(shí)仍能顯著提高錦鯉生長(zhǎng)性能，遠(yuǎn)高于葛紅云等[2]報(bào)道的添加量限值0.002%。這可能是飼料中添加棉子糖的適宜范圍值因魚的食性不同而有所差異。

3.3 棉子糖的代謝調(diào)節(jié)作用與錦鯉觀賞品質(zhì)

本課題組前期研究國(guó)內(nèi)外觀賞魚飼料品質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與日本產(chǎn)觀賞魚相比，國(guó)產(chǎn)觀賞魚飼料養(yǎng)殖的錦鯉具有體表色澤不夠鮮艷、色澤持久性差、魚體肌肉不夠緊實(shí)、魚腹脂肪堆積等特點(diǎn)，這降低了錦鯉觀賞價(jià)值。因此，若提升國(guó)產(chǎn)觀賞魚飼料的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，就必須重視其塑形、增色等功能性效果。

腹部脂肪堆積在醫(yī)學(xué)上被稱為腹型肥胖或向心性肥胖，通常被認(rèn)為與腸道微生物菌群的紊亂有關(guān)[21]。已有報(bào)道顯示，某些特定來(lái)源或結(jié)構(gòu)的低聚糖及多糖通過(guò)調(diào)控菌群相關(guān)機(jī)制能控制肥胖的發(fā)生和發(fā)展[22-23]。本研究中，飼料中添加0.06%和0.10%的棉子糖后，腸道菌群的Shannon指數(shù)從對(duì)照組的0.39分別提高至0.85和1.01，而全魚脂肪含量分別下降了21.65%和31.34%，脂肪沉積得以改善。說(shuō)明棉子糖對(duì)錦鯉的脂肪沉積、腸道微生物菌群多樣性等均有較明顯的改善作用，故推測(cè)棉子糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)部分腸道菌群、保護(hù)腸道屏障來(lái)發(fā)揮干預(yù)脂肪代謝的功效。通常認(rèn)為，魚類體內(nèi)脂肪代謝與其體表色澤相關(guān)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)飼料中添加0.06%棉子糖時(shí)，錦鯉體表皮膚亮度L*值與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，并未引起色澤下降的問(wèn)題。

綜合考慮臟體指數(shù)、肥滿度及全魚脂肪等體型相關(guān)指標(biāo)和體色亮度指標(biāo)及生產(chǎn)實(shí)踐中飼料配制的性價(jià)比，飼料中添加0.06%的棉子糖后，錦鯉的觀賞品質(zhì)優(yōu)于基礎(chǔ)飼料組，這表明棉子糖具有作為增色、塑形功能性飼料添加劑研究和開發(fā)的潛力。

4 結(jié)論

1)飼料中添加棉子糖后錦鯉增重率、特定生長(zhǎng)率顯著提高，說(shuō)明棉子糖能促進(jìn)錦鯉生長(zhǎng)。

2)飼料中添加棉子糖后全魚脂肪顯著降低，錦鯉體表L*值顯著上升，說(shuō)明棉子糖能提升錦鯉形體和體色亮度等指標(biāo)，從而提升錦鯉觀賞品質(zhì)。

3)飼料中添加棉子糖后，錦鯉血清SOD水平顯著提高；腸道微絨毛密度更高，微生物多樣性增加，且腸道微絨毛表面及腸道皺褶內(nèi)的食糜顆粒更少、更小，說(shuō)明棉子糖能改善錦鯉非特異性免疫、促進(jìn)錦鯉腸道健康。