白雨 劉文虎

100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腎內(nèi)科

近30年來，我國糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率逐年上升，全球近三分之一DM患者為我國患者[1]，其中大多數(shù)為2型DM(T2DM)[2]。據(jù)調(diào)查，全球超過4.15億人口患有DM，且據(jù)估計截止至2040年，DM人口將增長至6.42億[3]。T2DM是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性疾病，是一種復(fù)雜的異質(zhì)性的糖代謝性疾病，主要包括高血糖反應(yīng)、胰島功能受損和(或)胰島素分泌障礙，可引起多器官或組織功能失調(diào)，其并發(fā)癥包括：心血管疾病、腎臟損傷、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變，皮膚損傷等[4]。目前已知T2DM及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病機制包括蛋白激酶C通路、多元醇通路的激活，糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation ends，AGEs)、活性氧所致的組織損傷，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子及表觀遺傳學(xué)變化等[5]，其中表觀遺傳學(xué)變化(DNA甲基化和非編碼RNA)已逐漸成為研究熱點[6]。

非編碼RNA(non-coding RNA)分為微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(ciraclar RNA,circ RNA)等，雖不參與基因編碼合成蛋白，但卻發(fā)揮著多種重要生物學(xué)功能[7]。circ RNA是一種3′端與5′端相互連接的閉環(huán)非編碼RNA。由于檢測手段的限制，circ RNA曾被誤認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄錯誤的無功能RNA，隨著檢測手段的不斷提高，circ RNAs被證實為有功能的非編碼RNA[8]。與線性RNA相比，circ RNA穩(wěn)定性更強(因其呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏線性RNA的5′和3′游離末端，不易被核酸外切酶降解)，多數(shù)circ RNAs在不同物種間具有高度的保守性[9]。近年研究提示，circ RNA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[10]。本文將針對circ RNA的結(jié)構(gòu)特點、生物學(xué)功能及其與DM、DM相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系進行綜述。

一、circ RNA簡介

1.circ RNA結(jié)構(gòu)特點及檢測手段 circ RNA是一類以3′-5′磷酸二酯鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長鏈非編碼RNA[8]。20世紀(jì)90年代，研究者首次發(fā)現(xiàn)circ RNA的存在，在此后的20年中，由于檢測手段受限，circ RNA被認(rèn)為是基因表達過程中產(chǎn)生的無功能RNA，未得到重視。具體原因有以下幾點：(1)circ RNA與miRNAs和其他小RNA不同，不容易通過大小或電泳遷移率與其他RNA分離；(2)當(dāng)時使用的擴增和(或)片段化的分子技術(shù)破壞了其環(huán)狀結(jié)構(gòu)；(3)circ RNA沒有游離的3′或5′端，它們不能通過依賴于多聚腺苷化的游離RNA末端的分子技術(shù)，如cDNA末端的快速擴增(RACE)或Poly(A)富集，用于RNA-seq研究的樣品[11]。

隨著實驗技術(shù)的不斷進步，這些circ RNA研究相關(guān)的瓶頸問題近期正逐步得到解決?；赾irc RNA的一些特點，研究者發(fā)現(xiàn)以下幾種方法可以區(qū)分circ RNA及線性RNA。研究發(fā)現(xiàn)，通過提高凝膠的交聯(lián)程度，可使circ RNA的遷移率較線性RNA更慢，在二維凝膠電泳中，circ RNA通過高度交聯(lián)凝膠的遷移能力較差，在凝膠陷阱電泳中，circ RNA與融化的瓊脂糖混合后被交聯(lián)捕獲，在外加電場中不遷移[12]。此外，使用弱水解或靶向RNase H處理circ RNA，使其降解為多個大小可預(yù)測的線性RNA[13]。使用RNase R外切酶、煙酸磷酸酯酶和終止外切酶處理使circ RNA保持完整，但能有效降解大多數(shù)線性RNA[13]。以上3種方法可用于circ RNA的富集，但仍存在一定局限性，需要相互結(jié)合使用才能得到更可靠的研究結(jié)果。需要注意的是，套索RNA是在典型的RNA剪接過程中形成的，其在剪接點存在一個2′-5′碳鍵，因此在生物化學(xué)特性上不同于circ RNA。因此，在外切酶消化之前，可以先用去分支酶處理，從circ RNA中去除套索RNA。

此外，circ RNA相關(guān)的新型生物信息學(xué)工具(如CircleSeq)、具有長讀數(shù)和高通量的測序技術(shù)(高通量平行測序技術(shù))以及耗盡核糖體RNA(RRNA)的RNA文庫(而不是poly A富集文庫)的測序技術(shù)的出現(xiàn)，circ RNA的研究難點被逐步攻克，越來越多的研究者聚焦于circ RNA的生物學(xué)特點研究及其在機體生理、病理狀態(tài)下的生物學(xué)功能的相關(guān)研究[10]。

2.circ RNA的生物學(xué)功能

(1)miRNA海綿：miRNA是一種非編碼RNA，具有多種基因的調(diào)節(jié)功能，但一些實驗發(fā)現(xiàn)在某種情況下miRNA會失去功能。Margaret等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA可被含有其反義核苷酸的RNA吸附，競爭其結(jié)合位點起到阻斷其生物學(xué)功能的作用，可解釋miRNA失去功能的機制。此后，多項研究證實，circ RNA具有多個miRNA結(jié)合位點，競爭性吸附miRNA，阻斷其相應(yīng)的生物學(xué)功能。因此，circ RNA被稱為“miRNA海綿”。circ RNA的“miRNA海綿”作用是目前發(fā)現(xiàn)circ RNAs發(fā)揮功能的主要途徑[15-16]。

(2)調(diào)控轉(zhuǎn)錄：RNA的環(huán)狀化可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[11]。有研究者推測circ RNA可作為“mRNA陷阱”(mRNA trap)，隔絕翻譯起始點，非編碼RNA增多，編碼RNA減少，進而減少相應(yīng)蛋白的表達水平[17]。這一觀點在其他研究中得到證實。在人源及鼠源細(xì)胞的HIPK3基因的表達過程中，circ RNA的表達水平高于線性編碼RNA，且circ RNA的表達水平與線性編碼RNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平呈負(fù)相關(guān)?？梢?，基因選擇性表達促使RNA環(huán)狀化是調(diào)控蛋白翻譯的機制之一。此外，在多種疾病中，RNA環(huán)狀化水平改變被認(rèn)為是潛在的發(fā)病機制。

(3)與RNA結(jié)合蛋白(RNA bonding protein，RBPs)相互作用：circ RNA可與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，發(fā)揮一定生物學(xué)作用。Memczak等[18]在針對circ RNA CDR1as的研究中發(fā)現(xiàn)，circ RNA CDR1as可與AGO(一種miRNA結(jié)合蛋白，與miRNA結(jié)合發(fā)揮作用)相結(jié)合。研究者推測，circ RNA與RBPs相結(jié)合后增加了自身的穩(wěn)定性，并可促進相應(yīng)DNA增加circ RNA的轉(zhuǎn)錄，同時競爭性結(jié)合RBPs，使miRNA降解增加，抑制miRNA生物學(xué)作用[19]。

(4)翻譯模版：一些circ RNA內(nèi)部含有連續(xù)型開放閱讀框，真核細(xì)胞40S核糖體可翻譯含內(nèi)部核糖體進入位點的circ RNA，但Jeck等[17]研究提示，雖然一些circ RNA含有AUG翻譯起始點，仍不能與核糖體結(jié)合。關(guān)于circ RNAs作為翻譯模版的生物學(xué)作用有待進一步深入研究。

二、circ RNA與DM

Stoll等[20]檢測了2型DM患者及DM動物模型胰島組織中circHIPK3和ciRS-7的表達水平，發(fā)現(xiàn)DM患者胰島組織中circHIPK3和ciRS-7的表達水平顯著升高，而在DM動物模型胰島組織中其表達水平則明顯降低。circHIPK3通過阻斷miR-124-3p和miR-338-3p調(diào)控Slc2a2，Akt1和Mtpn等基因，影響胰島β-細(xì)胞的分泌功能。ciRS-7則通過阻斷miR-7發(fā)揮相應(yīng)作用，影響β-細(xì)胞功能。

Li等[21]收集2型DM患者、冠心病患者及健康人群的外周血進行circ RNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)40種差異表達的RNA(13種上調(diào)，27種下調(diào))，從中篩選出5個表達差異顯著的RNA應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在各組相應(yīng)隊列中進行驗證，最終結(jié)果表明has-circ-11783-2與2型DM及冠心病密切相關(guān)。has-circ-11783-2的源基因是ENST00000251081，其編碼產(chǎn)物是橋粒膠蛋白亞家族成員，有研究證實此基因突變與心臟疾病存在相關(guān)性，但尚無研究證實其與DM相關(guān)[22]。因此，has-circ-11783-2與DM的關(guān)系需要進一步實驗證實。Zhao等[23]采集了2型DM患者和健康人群的外周血進行circ RNA微陣列分析，并在臨床隊列中進行驗證，發(fā)現(xiàn)has-circ-0054633表達差異顯著，基因分析提示has-circ-0054633參與了細(xì)胞周期調(diào)控過程及細(xì)胞內(nèi)分子代謝，與胰島β細(xì)胞及胰島素分泌密切相關(guān)。王思思等[24]研究者通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選了3個胰島素信號通路相關(guān)的circ RNA，收集 50 例新診斷T2DM患者、40例IFG患者及50名體檢健康人群的臨床資料，檢測生化指標(biāo)及相關(guān)circ RNA水平。研究結(jié)果提示，在DM患者血清中hsa_circ_0056891、hsa_circ_0063425、hsa_circ_0071336 表達水平降低，調(diào)整多個因素后統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果提示hsa_circ_0056891、hsa_circ_0063425、hsa_circ_0071336 T2DM表達水平降低是2型DM的獨立預(yù)測因子，且可能在T2DM及IFG的發(fā)病機制中起重要作用。

三、circ RNA與DM相關(guān)并發(fā)癥

circ RNA不僅在DM及胰島組織中起到一定作用，在DM各類并發(fā)癥中也起到重要作用。

1.糖尿病腎病 糖尿病腎病是DM重要的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。目前認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)改變是糖尿病腎病重要發(fā)病機制之一[25]，其中circ RNA的作用尚未完全明確。Wei等[26]研究者發(fā)現(xiàn)db/db小鼠腎組織中circRNA_15698表達水平較對照組明顯升高，且在高糖刺激后腎小球系膜細(xì)胞中得到驗證，circRNA_15698可通過miR-185/TGF-β1通路，下調(diào)miR-185，阻斷其對TGF-β1的干擾作用，從而加重細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。范秋靈等[27]發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞中hsa_circ RNA_404975表達水平較對照組顯著升高，hsa_circ RNA_103142表達水平較對照組顯著下降，在加入caspase-1抑制劑后上述circ RNA表達差異較對照組減小，提示circ RNA可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變，并與炎癥及焦亡機制相關(guān)。circ RNA在糖尿病腎病發(fā)病機制中的具體作用有待進一步研究證實。

2.DM相關(guān)心血管病變 心血管疾病是DM的主要并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計65%的DM死亡患者的死亡原因為心血管系統(tǒng)疾病[28]。研究發(fā)現(xiàn)，circ RNA參與了DM心肌病變、血管損傷等過程。Bing等[29]通過檢測db/db小鼠心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)circRNA_010567表達水平較對照組升高，并通過調(diào)控miR-141/TGF-β1通路促進心肌細(xì)胞的纖維化，加重DM心肌病變。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)高糖刺激后的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscular cells，VSMCs)中circ WDR77表達水平顯著升高，并通過miR-124/FGF-2通路調(diào)控高糖環(huán)境下VSMCs的增殖和細(xì)胞遷移。Pan等[31]發(fā)現(xiàn)高糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VECs)后circ RNA_0054633表達水平上調(diào)，調(diào)控下游miR-218/ROBO1和miR-218/HO-1通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。Ying等[32]發(fā)現(xiàn)高糖刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)中circHIPK3表達水平顯著下調(diào)，在HUVECs中，circHIPK3是通過吸附miR-124，阻斷其下調(diào)SphK1-STAT3的生物學(xué)功能，從而起到細(xì)胞保護功能，但高糖刺激下細(xì)胞內(nèi)circHIPK3表達水平下調(diào)，造成miR-124聚集，SphK1-STAT3水平降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。

3.DM視網(wǎng)膜病變 DM視網(wǎng)膜病變是DM的重要微血管并發(fā)癥之一，DM視網(wǎng)膜病變患者的逐年增多導(dǎo)致全球盲人數(shù)量劇增[3]。研究發(fā)現(xiàn)，circ RNA同樣參與了DM視網(wǎng)膜內(nèi)皮損傷過程。Kun等[33]發(fā)現(xiàn)在DM情況下，人源及鼠源視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中，circHIPK3表達水平顯著升高，并經(jīng)過在體實驗驗證circHIPK3通過吸附miR-30a-3p上調(diào)VEGFC、FZD4、WNT2水平，介導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。

4.DM周圍神經(jīng)病變 DM周圍神經(jīng)病變是較常見的DM并發(fā)癥，約三分之一的DM患者患有DM周圍神經(jīng)病變[34]。Liang等[35]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性疼痛的DM患者血清中含有大量circHIPK3，且circHIPK3的上調(diào)與2型DM患者的分級神經(jīng)性疼痛呈正相關(guān)。動物實驗研究證實，STZ誘導(dǎo)DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)circHIPK3水平、IL-1β、IL-6、IL-12及TNF-α等炎癥因子水平及疼痛評分顯著升高，而敲除circHIPK3可降低上述炎癥因子水平及疼痛評分，進一步研究表明其機制可能是circHIPK3通過吸附miR-124，阻斷其控制炎癥和神經(jīng)性疼痛功能，從而導(dǎo)致DM周圍神經(jīng)病變所致的神經(jīng)型疼痛，其下游具體機制有待進一步研究證實。

四、展望

近年來，circ RNA在DM及其并發(fā)癥中的作用及機制研究逐漸成為熱點。隨著研究的不斷深入，目前認(rèn)為circ RNA在DM及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，深入探究circ RNA在DM及其并發(fā)癥中的作用及具體機制可為DM及其并發(fā)癥的早期診斷和治療提供新的思路。