曹東東 黎妞 曹子彧 侯玉龍 倪文娟 冷小敏 劉云 師晶晶 郭明好 馬東紅

453100 衛(wèi)輝，河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎臟免疫研究所(曹東東，黎妞，倪文娟，劉云，馬東紅，曹子彧，侯玉龍，師晶晶，郭明好)，生命科學(xué)研究中心(冷小敏)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)主要并發(fā)癥之一，由其引起的終末期腎病的發(fā)病率正逐年上升[1]，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。以往的研究認(rèn)為，高血糖、游離脂肪酸和胰島素抵抗誘導(dǎo)了代謝失衡和DKD啟動(dòng)，而近年來(lái)炎癥被認(rèn)為在DKD發(fā)展中起到重要作用[2-3]。白介素10(interleukin-10，IL-10)作為一種抗炎細(xì)胞因子，已被證實(shí)可以限制促炎細(xì)胞因子的激活[4]。有研究通過IL-10對(duì)小鼠系膜增生性腎小球腎炎的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-10可減少炎癥細(xì)胞募集和系膜細(xì)胞增殖[5]。當(dāng)IL-10通過基因治療的方式被傳遞給自然發(fā)生腎衰竭的小鼠時(shí)，可有效減少蛋白尿及預(yù)防小鼠腎小球硬化的發(fā)生，提示IL-10基因治療可以用于腎衰竭治療[6]。因此建立良好的DKD動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制及治療該疾病具有重要意義。

目前DKD模型建立主要包括：高糖高脂聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、單側(cè)腎切聯(lián)合STZ、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。有研究通過腹腔注射STZ聯(lián)合單側(cè)切除腎臟的方法加速腎臟損傷，縮短實(shí)驗(yàn)周期[7]，但該方法操作復(fù)雜、腹腔感染和死亡率高，也不符合正常DKD正常生理發(fā)病機(jī)制。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型通過人為對(duì)動(dòng)物基因進(jìn)行修飾，但該方法明顯加大了遺傳因素在DKD發(fā)病過程中的主導(dǎo)作用，并且該模型價(jià)錢昂貴，這也限制了該模型的應(yīng)用。同時(shí)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于DKD成模時(shí)間、成模標(biāo)準(zhǔn)均不統(tǒng)一[8-9]，有些研究經(jīng)常將DM造模成功后默認(rèn)為DKD模型進(jìn)行后續(xù)研究，這是欠妥的，以上差異往往會(huì)影響模型成功率和可重復(fù)性。因此本研究在前人基礎(chǔ)上對(duì)DKD大鼠造模方法進(jìn)行改進(jìn)并檢測(cè)大鼠腎組織IL-10水平變化，為開辟新型IL-10的DKD治療策略提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和喂養(yǎng) 48只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠[購(gòu)買于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：180325，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(晉)20150001]，體質(zhì)量160～200 g，月齡5～8周，自由飲水和攝食，室溫控制在(24±2)℃，濕度45%～50%，自然光照。

2.主要試劑與儀器 高糖高脂飼料(貨號(hào)：HD001，博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)；STZ(貨號(hào)：S0130，Sigma公司)；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(篤瑪生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒、HE染色試劑盒(索來(lái)寶公司)；IL-10抗體(貨號(hào)：DF6894，Affinity公司)；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(貨號(hào)：AB0101，Abways公司)；貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；FUS-2000全自動(dòng)尿液分析儀(上海伊沐醫(yī)療器械有限公司)；光學(xué)顯微鏡(賽默飛世爾公司)；BM-IX生物組織包埋機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；羅氏血糖儀活力型及配套血糖試紙條(美國(guó)羅氏公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物模型的建立 48只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=24)和糖尿病組(DM組，n=24只)，NC組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，DM組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。6周后兩組禁食不禁水16 h，DM組按40 mg/kg一次性腹腔注射STZ(將STZ溶于0.1 mmol/L pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，濃度為1%，避光，現(xiàn)配現(xiàn)用)，NC組給予等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液一次性腹腔注射。STZ注射后分別于72 h、1周后測(cè)隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L、測(cè)尿糖2次均為陽(yáng)性，則為DM造模成功[10]，DM組繼續(xù)以高糖高脂喂養(yǎng)。

2.標(biāo)本的收集 造模成功后分別于0、4、8、12周從兩組中各處死6只大鼠，處死前用代謝籠收集隨機(jī)尿液，檢測(cè)尿微量白蛋白、尿肌酐及尿糖，計(jì)算尿微量白蛋白/尿肌酐比(urinary protein creatinine ratio，UACR)；用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，然后進(jìn)行心臟灌注，先以生理鹽水灌至澄清，再以4%多聚甲醛固定，取出腎臟并去除腎包膜，冠狀面切開腎臟置于多聚甲醛中進(jìn)行固定，用于后續(xù)進(jìn)行常規(guī)HE染色、PAS染色、Masson三色法染色、PASM法染色及免疫組化檢測(cè)。

3.測(cè)量指標(biāo)及方法 (1)生化指標(biāo)的檢測(cè)：尿微量白蛋白、尿肌酐采用全自動(dòng)生化分析儀，并計(jì)算UACR，UACR(mg/g)=尿微量白蛋白(mg/L)/尿肌酐(μmol/L)×8840，尿糖采用全自動(dòng)尿液分析儀。血糖檢測(cè)使用羅氏血糖儀及配套試紙。

(2)腎組織病理：取出固定好的腎臟標(biāo)本石蠟包埋切片，切片厚度約2～3 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，100%、95%、80%、65%梯度酒精脫水，進(jìn)行HE染色、PAS染色、Masson三色法染色、PASM法染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。

(3)免疫組化檢測(cè)腎組織IL-10表達(dá)：4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度約2～3 μm，二甲苯脫蠟、各級(jí)酒精脫水，微波抗原修復(fù)，3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉，滴加鼠抗兔IL-10一抗(1∶50)37℃ 1h或4℃過夜，滴加羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗，DAB顯色后蘇木素染核，封片，陰性對(duì)照以PBS取代一抗。應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)測(cè)量累計(jì)光密度值以及組織的像素面積，得到平均光密度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、DM造模結(jié)果

與NC組相比，DM組大鼠在注射STZ 72 h、1周后采尾靜脈血測(cè)隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L、尿糖陽(yáng)性的有18只，成模率為75%，隨后對(duì)未成模大鼠以1%STZ 30 mg/kg進(jìn)行補(bǔ)充，再次測(cè)血糖均達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束共死亡3只大鼠。實(shí)驗(yàn)期間觀察DM組大鼠多飲、多食、多尿癥狀明顯，毛發(fā)發(fā)黃、晦暗；NC組大鼠狀態(tài)良好，體質(zhì)量逐漸增加。

二、兩組大鼠的一般項(xiàng)目和血生化指標(biāo)比較

同期兩組大鼠在0、4、8周時(shí)體質(zhì)量相比較無(wú)差異，至第12周時(shí)，DM組大鼠平均體質(zhì)量為(478.0±79.1)g，明顯低于NC組(650.0±26.9)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與DM組相比，NC組體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯；DM組大鼠血糖在造模成功后0周血糖(25.6±5.3)mmol/L，顯著高于NC組(5.2±0.2)mmol/L，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束發(fā)現(xiàn)血糖仍維持在(23.0±5.5)mmol/L；DM組大鼠UACR在8周、12周分別為(39.0±18.6)mg/g、(77.0±12.3)mg/g，均顯著高于同期對(duì)照組(15.1±5.4)mg/g、(15.8±7.0)mg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖1)

三、腎臟病理結(jié)構(gòu)改變

NC組不同時(shí)期光鏡下大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)均未見明顯異常；DM組各期在光鏡下各種染色均可顯示腎間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，于第12周腎小球基底膜輕度增厚，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性(圖2)。

四、兩組大鼠腎組織IL-10表達(dá)比較

采用免疫組化檢測(cè)兩組腎組織IL-10的表達(dá)，IL-10陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域呈棕黃色，且IL-10表達(dá)主要集中在腎小管的上皮細(xì)胞，可見在兩組中均有表達(dá)。NC組各期腎組織IL-10表達(dá)量較同期DM組較高(P<0.05)，且DM組不同時(shí)期相比IL-10表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(圖3、圖4)

討 論

DKD已成為終末期腎病首要病因，但發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，構(gòu)建理想的DKD動(dòng)物模型對(duì)研究該疾病發(fā)病機(jī)制及提供相應(yīng)的干預(yù)措施十分重要。本課題組通過查閱大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ已成為研究DKD模型的常用方法。本研究通過高糖高脂聯(lián)合小劑量STZ(40 mg/kg)成功建立DM模型，DM組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿癥狀，且至12周DM組大鼠體質(zhì)量為(478.0±79.1)g，明顯低于NC組(650.0±26.9)g；DM組大鼠血糖于造模成功后0周即顯著高于NC組(25.6±5.3)mmol/L，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束發(fā)現(xiàn)血糖仍維持在(23.0±5.5)mmol/L；與NC組相比，DM組在0周時(shí)UACR水平較高，而在4周再次測(cè)量顯示UACR趨于下降，分析其原因?yàn)?周時(shí)DM組大鼠由于高血糖引起高滲透壓，使腎臟處于高濾過狀態(tài)導(dǎo)致大鼠尿微量白蛋白排泄增多[11]，至8周后UACR與同期對(duì)照組相比均較高，提示腎臟損傷不斷加重；此外，與NC組相比，DM組腎臟病理光鏡下各種染色均可顯示腎間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，于第12周出現(xiàn)腎小球基底膜輕度增厚，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，相比一些文獻(xiàn)報(bào)道8周即伴有腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞基質(zhì)增多有所差異[10]。另外本研究還對(duì)大鼠腎組織抗炎因子IL-10進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)DM組各周IL-10表達(dá)與NC組相比均較低，分析原因?yàn)樵贒KD初期，機(jī)體免疫平衡被打破，引起腎內(nèi)皮細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞增生使細(xì)胞因子釋放增多、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制抗炎因子釋放從而引起IL-10表達(dá)降低。

目前對(duì)于DKD的造模方法較多，如從動(dòng)物種類的選擇、不同STZ的劑量、造模時(shí)間、成模標(biāo)準(zhǔn)判斷等方面均有較大差異，這種差異往往會(huì)影響模型的成功率和可重復(fù)性。Abdelrahman等[12]將雄性SD大鼠腹腔注射STZ 65 mg/kg，注射7小時(shí)后尾靜脈測(cè)隨機(jī)血糖大于20 mmol/L為DM模型，并且與對(duì)照組相比STZ誘導(dǎo)DM大鼠體質(zhì)量下降、UACR增加，腎臟形態(tài)學(xué)改變?yōu)槟I小球系膜細(xì)胞輕度增加，腎小管上皮明顯空泡變性，局灶腎小管壞死。Mensah等[13]則將Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg誘導(dǎo)DM模型，于1月和8月進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比體質(zhì)量均降低，光鏡下形態(tài)學(xué)1個(gè)月時(shí)腎小管擴(kuò)張，8個(gè)月時(shí)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管損傷及胞漿染色丟失。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)DKD動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)尚缺乏統(tǒng)一性，經(jīng)常將DM模型成功后默認(rèn)為DKD模型進(jìn)行后續(xù)研究，這是欠妥的。另外根據(jù)Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn)：UACR和腎臟病理的形態(tài)改變是DKD分期的關(guān)鍵，因此監(jiān)測(cè)血糖、UACR和腎臟病理對(duì)DKD模型的建立至關(guān)重要。本研究的意義在于從不同時(shí)期觀察高糖高脂聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)的DM動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)SD大鼠一般狀況、血生化指標(biāo)、腎臟病理改變，對(duì)DKD模型的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化提供可視化數(shù)據(jù)，因此我們從價(jià)格、可操作性、模型成功率、成模標(biāo)準(zhǔn)等方面考慮，建議對(duì)于DKD模型評(píng)判從8周開始檢測(cè)腎臟損傷臨床指標(biāo)如尿微量白蛋白和12周進(jìn)行腎臟病理的觀察，從而進(jìn)行更準(zhǔn)確地對(duì)DKD模型進(jìn)行評(píng)判。

DKD是由DM引起的慢性腎病，病理改變以腎小球系膜增生、基底膜增厚、腎小管萎縮而導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化為特征[14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在DKD發(fā)病過程中，炎癥起了至關(guān)重要作用，而炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子在發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[2，15-16]。IL-10作為抑制炎癥的細(xì)胞因子來(lái)限制炎癥引起的組織破壞，它主要由Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌[17]。有研究發(fā)現(xiàn)DKD患者外周血中IL-10水平升高，并且Il-10與蛋白尿呈正相關(guān)，這提示IL-10水平的升高似乎與DKD患者嚴(yán)重程度有關(guān)[18]。另有研究顯示與正常對(duì)照組相比，IL-8、IL-10水平增高隨著DKD嚴(yán)重程度增加而增加，IL-10水平增高在一定程度上提示了DKD和炎癥有關(guān)[19]。Guo等[20]發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)DKD大鼠模型中IL-10、IL-4水平降低，而IL-12、干擾素(interferon，INF)-γ、INF-α水平升高，用雷公藤內(nèi)酯處理DKD大鼠后發(fā)現(xiàn)IL-10水平增加。我們通過觀察發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間DM組大鼠IL-10水平均低于NC組，進(jìn)一步提示炎癥在DKD發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)還存在一些局限性：(1)考慮到大鼠和人類在基因上的差異，DKD動(dòng)物模型并不能完全與人類DKD病理改變一致；(2)本實(shí)驗(yàn)造模時(shí)間短，DM組并沒有出現(xiàn)典型的DKD腎臟病理改變，還需要進(jìn)一步延長(zhǎng)造模時(shí)間及動(dòng)態(tài)檢測(cè)IL-10水平的變化；(3)所使用的樣本量較小，這可能在結(jié)果統(tǒng)計(jì)上存在差異，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證本研究結(jié)果。

綜上本實(shí)驗(yàn)表明高糖高脂聯(lián)合小劑量STZ建立DKD模型8周出現(xiàn)明顯尿微量白蛋白尿和12周出現(xiàn)腎小球基底膜輕度增厚、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性等病理改變，同時(shí)腎組織IL-10表達(dá)降低進(jìn)一步論證IL-10參與DKD發(fā)病并有可能作為DKD治療的靶點(diǎn)。