陳海云 敖英 朱亞男 汪暉

430071 武漢，武漢大學基礎醫(yī)學院藥理學系發(fā)育源性疾病湖北省重點實驗室

足細胞是腎小球臟層上皮細胞，對于維持腎小球濾過屏障的結構和功能具有重要意義。研究表明，在一些理化因素的刺激下，足細胞會出現(xiàn)損傷或功能障礙，嚴重者出現(xiàn)細胞凋亡和脫落，導致腎小球硬化和腎功能損害[1]。上述損傷因素也會致使足細胞發(fā)生上皮-間質轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，足細胞功能蛋白Ⅰ型腎母細胞瘤(Wilms’tumor 1，WT1)、去氧腎上腺素等表達減少，并伴隨蛋白尿、腎小球玻璃樣變等病理現(xiàn)象。足細胞EMT是足細胞損傷的早期事件，且足細胞EMT在多種腎小球疾病中都扮演著重要的角色。本文將圍繞足細胞EMT展開闡述，對足細胞EMT的影響因素、發(fā)生機制以及足細胞EMT與腎小球疾病的關系進行綜述，擬展現(xiàn)足細胞EMT及其所致疾病的最新研究進展。

一、足細胞EMT

EMT是指在各種理化因素作用下，上皮細胞失去其表型特征，并獲得間質細胞表型的病理生理學改變。這種細胞分化和轉變由關鍵轉錄因子介導，包括蝸牛家族Snail、鋅指E盒結合和堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子。足細胞為不可再生細胞，附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)外側，與內皮細胞及其他蛋白多糖等共同構成腎小球濾過屏障。近年來的研究表明，在損傷因素作用下，足細胞會產生一系列形態(tài)學改變，并可能發(fā)生EMT。

足細胞EMT的主要表現(xiàn)為細胞骨架蛋白重排、足突融合和裂孔膜間隙增大；足細胞表型標志物如nephrin、podocin、P-cadherin、WT1等表達降低，間質細胞標志物如結蛋白(desmin)、成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP-1)、波形蛋白(vimentin)、平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA)等表達上調，同時受損的足細胞從GBM上脫落使足細胞數(shù)量減少，GBM裸露，破壞腎小球濾過膜完整性，腎小球功能發(fā)生改變，產生蛋白尿，進一步發(fā)展成為腎小球硬化。已證實，EMT是足細胞損傷的早期事件，可進一步引起細胞凋亡和脫落，因而在腎小球硬化中起至關重要的作用[2]。

二、足細胞EMT的誘因

足細胞EMT是足細胞損傷的一種表現(xiàn)形式，也是導致多種腎小球疾病的始動因素之一。導致足細胞損傷的因素主要可分為先天因素(遺傳因素)和后天因素兩類。研究表明，凡是能夠誘使足細胞損傷的因素都可能引起足細胞發(fā)生EMT[3]。

1.先天因素 遺傳因素是影響機體生長發(fā)育的重要內因之一，它包括染色體組學、基因組學。WT1在腎臟發(fā)育過程中可促進后腎間充質干細胞經間充質-上皮細胞轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)分化為足細胞，對足細胞的形成和成熟至關重要。報道指出[4]，錯義突變或足細胞條件性敲除WT1可導致人和小鼠腎小球瘢痕化。由WT1錯義突變誘導的小鼠腎小球硬化模型導致足細胞緊密連接蛋白(Zonula occludens 1，ZO-1)表達降低和足細胞轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達上調[5]，進一步可引發(fā)足細胞EMT，提示W(wǎng)T1可能是足細胞EMT的關鍵調節(jié)劑。基因的甲基化和去甲基化是一種常見的表遺傳修飾形式，可參與許多生物過程。有研究指出[6]，基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)啟動子去甲基化可促進足細胞EMT，但其機制有待進一步研究。另有研究指出，由DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)直接介導的Kruppel樣因子4(kruppel-like factor 4，KLF4)的高甲基化有助于腎上皮細胞中EMT的進展[7]。由此推測，表遺傳修飾異常也可能是足細胞EMT的一種誘因。

2.后天因素 除了先天因素外，足細胞發(fā)育不良、腎素-血管緊素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)、活性氧(reactive oxygen，ROS)、脂質及炎癥因子等很多誘導因素也可以促進足細胞發(fā)生EMT。

足細胞作為一種終末分化細胞，其發(fā)育成熟后不具再生性，故足細胞發(fā)育異常亦可引起足細胞EMT。足細胞發(fā)育不良會引起足細胞缺失和功能障礙[8]。nephrin作為足細胞的重要功能蛋白，它的正常表達在很大程度影響足細胞的狀態(tài)。胚胎時期，nephrin表達缺失是足細胞發(fā)育不良的標志之一，可導致足突和裂孔膜的形成障礙。成年個體nephrin缺失標志著足細胞上皮表型的破壞，同時也可以激活β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路誘導足細胞發(fā)生EMT，促進腎小球硬化發(fā)生。孕期不良環(huán)境暴露可引起低出生體重和早產，繼而影響足細胞發(fā)育。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，孕期咖啡因暴露會引起胎兒宮內發(fā)育遲緩，并引起胎腎結構與功能的損傷，足細胞標志基因nephrin表達降低，致胎兒足細胞發(fā)育不良，并導致成年子代蛋白尿和腎小球硬化礙[9]。而我們的進一步研究也發(fā)現(xiàn)，足細胞發(fā)育不良大鼠成年后其足細胞表型向EMT轉變，如上皮細胞標志基因nephrin、WT1等表達降低，間質細胞標志基因desmin、α-SMA等的表達上調礙[10]。以上研究提示，足細胞的發(fā)育異常不僅會引起足細胞功能障礙，更可能導致足細胞EMT的發(fā)生。

Ang II的過度生成通過激活受體AT1R促進TGF-β1等細胞因子的表達，誘導系膜細胞外基質合成，并促進轉錄因子8(transcription factor 8，TCF8)的轉錄，抑制上皮基因表達進一步促進足細胞EMT[11]。ROS是足細胞損傷和慢性腎病進展的重要促進因素，可促進足細胞凋亡，ROS的增加可引起足細胞損傷和蛋白尿，繼而出現(xiàn)腎臟炎癥、腎小球硬化和間質纖維化礙[12]。Ang II可以增加足細胞中ROS的產生，從而介導F-肌動蛋白骨架重排，導致足細胞損傷甚至凋亡礙[13]，證實這種ROS異?；罨鸬牡鞍坠羌苤嘏?、TGF-β釋放增加、細胞外基質合成等均會致使足細胞發(fā)生EMT。脂質代謝異常與足細胞EMT的發(fā)生也密切相關。研究表明，低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)的蛋白表達與α-SMA蛋白表達呈正相關，與nephrin蛋白表達呈負相關。脂質積累促進Ⅰ型膠原蛋白(Type 1 collagen)、α-SMA和纖維連接蛋白(Fibronectin)的表達，并降低了足細胞中nephrin的表達。這證實LDL-R途徑誘導的脂質積累可誘導足細胞EMT。一系列報道顯示礙[14]，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎性細胞因子通過下調E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、ZO-1等上皮標志物的表達，上調α-SMA、Fibronectin等間充質標志物的表達來誘導EMT，雖然未見到其關于足細胞EMT的相關報道，但炎性細胞因子可誘導EMT是確認的。

三、介導足細胞EMT的信號通路

介導足細胞EMT的通路有許多種，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的主要信號通路有TGF-β/smad、Wnt/β-catenin和Notch。這些通路既有各自的信號傳導路徑，又在不同層面相互連接、整合，組成錯綜復雜的網(wǎng)絡，共同介導和調控足細胞EMT的過程。

1.TGF-β/Smad信號通路 轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前已知誘導足細胞EMT的最主要因子，也是誘導各種細胞纖維化形成的樞紐環(huán)節(jié)。TGF-β1之所以能發(fā)揮其生物功能，主要依靠以 Smad 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)為主的信號途徑。在一定刺激下，TGF-β1受體被激活后，磷酸化并激活 Smad2、Smad3，活化的Smad2、Smad3 與 Smad4 形成復合物并一同進入細胞核內，促進整合素鏈接激酶(integrin linked Kinase，ILK)、整合素-β1(β1-integrin)、Wnt、Snail、α-SMA和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloprotein-2，MMP-2)等轉分化相關基因的表達，上調β-catenin的表達，從而促進EMT的發(fā)生。已有研究報道，β-catenin的激活可以下調上皮標志物E-cadherin和ZO-1的表達，而上調α-SMA等的表達。這證實β-catenin蛋白轉導參與誘導EMT過程。TGF-β1信號通過Smad直接增加LEF1的表達，并通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt途徑抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)，使β-catenin依賴性激活淋巴增強因子1(LEF-1)誘導EMT，同時也有研究證實，抑制TGF-β1的表達可以阻止腎小球硬化及纖維化的發(fā)生，減少間質細胞相關基因Ⅳ型膠原和纖黏蛋白的表達[16]。可見，TGF-β/Smad通路在介導EMT的過程中扮演了重要角色。實驗證明，TGF-β/Smad通路可引起體外培養(yǎng)的足細胞發(fā)生EMT，且足細胞EMT的程度與TGF-β1呈劑量依賴增加，TGF-β1可通過激活PI3K/PKB信號通路，調節(jié)足細胞基質的粘附和纖維連接蛋白基質沉積，促進EMT進程[17]。

2.Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號傳導途徑幾乎涉及胚胎發(fā)育的每個方面。Wnt(Wingless and lnt1)信號是一種跨膜信號，參與細胞的分化和運動，腎臟的發(fā)育、形態(tài)以及功能的維持均有賴于 Wnt 信號通路正常“開啟”和及時“關閉”，但其在成人腎臟中的表達基本是維持不變的。Wnt 信號通路在足細胞中的激活通常與蛋白尿和腎小球硬化進展有關。β-catenin是Wnt的下游信號分子，當 Wnt 配體與卷曲受體蛋白Frizzled(Fz)受體以及低密度脂蛋白受體關聯(lián)蛋白6(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP6)或者其類似物(LRP5)相關結合時，Wnt 信號通路被激活，GSK-3β不能使β-catenin磷酸化，β-catenin 穩(wěn)定游離在胞質中，聚積后轉位至細胞核。核β-catenin與 T 細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)轉錄因子家族的成員結合以促進EMT。最新研究表明，在糖尿病腎病患者中，Wnt/β-catenin 信號通路激活，誘導 β-catenin 表達增加，從而加速足細胞 EMT礙[18]，最終導致足細胞功能紊亂。

3.Notch信號通路 Notch信號通路與TGF-β/Smad信號通路存在交互作用，Notch途徑為TGF-β1介導EMT進程所必需。Notch信號可以通過誘導缺氧誘導因子1a(Hypoxia-inducible factor 1a，HIF-1a)間接促進Snail1的表達，其中Snail1是轉錄阻遏物，在調節(jié)EMT中起關鍵作用。研究表明礙[19]，Notch途徑通過激活Snail1誘導EMT。Snail1表達的上調可以通過抑制上皮細胞標志物E-cadherin的表達，促進間質細胞標志物N-cadherin及vimentin的表達，進而使足細胞發(fā)生EMT。另外Snail2與Notch相互作用，對于Notch介導的E-cadherin的抑制和β-catenin的激活是必需的。除了由細胞內結構域介導的直接作用外，Notch還通過各種信號通路(包括NF-κB和β-catenin)以及各種調控miRNA的作用間接調控EMT礙[20]。

如前所述，3條信號通路都可以激活足細胞的EMT，且在某種程度上，β-catenin 作為一個共同的開關，使TGF-β、Notch和Wnt 信號通路在不同的層面相互連接、整合，成為調控EMT所必需的轉錄分子及信號媒介。

四、足細胞EMT與腎小球疾病

足細胞損傷是多種腎小球疾病的共同病理基礎，包括糖尿病腎病、腎小球硬化、IgA型腎病等。EMT是足細胞損傷的早期事件，可進一步誘發(fā)多種腎小球疾病。

1.足細胞EMT與糖尿病腎病 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最嚴重的并發(fā)癥之一，也是全世界終末期腎病發(fā)病的主要原因，常見的臨床特征為進行性蛋白尿，腎臟足細胞損傷是引起蛋白尿的關鍵靶點。Liu[21]認為，損傷早期的足細胞EMT是使腎小球濾過屏障受損發(fā)生蛋白尿的主要因素，終止足細胞EMT可早期防治蛋白尿的發(fā)生，緩解DN的進程。高糖可從多途徑引起足細胞EMT，如叉頭狀轉錄因子O1(Forkhead transcription factor O1，F(xiàn)oxO1)在抗氧化應激、糖脂代謝等方面發(fā)揮重要作用。在足細胞中，F(xiàn)oxO1可能通過抑制TGF-β/Smad/ILK信號通路過度激活，減輕高糖誘導的足細胞EMT，從而緩解DN甚至足細胞損傷礙[22]；結締組織生長因子(CTGF)誘導的足細胞損傷可能導致DN，抑制CTGF可通過減少β-catenin的表達來預防足細胞EMT，緩解DN進程礙[23]；胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP7)參與調節(jié)DN中足細胞的損傷，沉默IGFBP7可通過抑制TGF-β/Smad途徑抑制HG介導的足細胞EMT，IGFBP7可作為DN的新型診斷和治療靶標[24]等。

隨著對分子生物學的認識越來越深入，人們發(fā)現(xiàn)非編碼單鏈RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)與DN中足細胞EMT之間關系密切。有報道稱，miR-124a可通過抑制小窩蛋白-1(caveolin 1，cav-1)和β-catenin的激活來減弱DN所致的足細胞EMT[25]；miR-133b和miR-199b的敲低可減輕DN中TGF-β誘導的足細胞EMT[26]；lncRNA ENSRNOG00000037522的上調通過抑制nephrin等的表達增強DN中的足細胞EMT等[27]。這些研究提示，非編碼RNA與足細胞EMT及DN的發(fā)生、發(fā)展關系密切，其有望成為DN防治的潛在靶標。

2.足細胞EMT與腎小球硬化癥 足細胞EMT是腎小球硬化的始動因素。腎小球硬化癥是一種以腎小球病變?yōu)橹鞯呐R床病理綜合征，其典型病理特征為腎小球玻璃樣變、系膜細胞增生及細胞外基質過量沉積，臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿和腎功能進行性惡化。它是各種慢性腎小球疾病向終末期腎病進展和惡化的共同病理階段。當腎小球受到損傷時，足細胞會發(fā)生一系列的表型改變甚至脫失。有研究指出，在多數(shù)病理生理條件下足細胞的主要反應是發(fā)生EMT[28]。最近的實驗表明，足細胞在損傷后可能經歷EMT，這種表型轉化導致足細胞失去其特化的上皮特征并獲得新的間充質標記物，這一轉變無疑會損害腎小球濾過屏障的完整性，導致蛋白尿發(fā)生[29]。這種腎小球功能性異常進一步可誘發(fā)一系列腎小球疾病，最終致腎小球硬化。

3.足細胞EMT與免疫球蛋白A(IgA)腎病 IgA腎病是最為常見的一種原發(fā)性腎小球疾病，其特征在于腎小球系膜細胞中IgA的沉積。以往臨床上IgA腎病主要是以系膜區(qū)IgA沉積為病理特征，研究也多集中于系膜細胞在腎小球硬化中的作用。但近幾年來，足細胞病變在腎小球腎炎進展中的作用越來越受矚目。目前的研究表明，足細胞損傷在IgA腎病的腎小球硬化中起著重要作用。IgA1是IgA腎病中公認的關鍵性致病因子。越來越多的報道指出，系膜區(qū)內未成熟的IgA1沉積可能是IgA腎病的致病機制[30]。IgA腎病中IgA1直接下調了足細胞標記物nephrin的mRNA表達，最終導致蛋白尿的形成。同時大量伴有蛋白尿的IgA腎病患者足細胞中表現(xiàn)出顯著的α-SMA和FSP-1的mRNA表達增加[31]。這些結果均表明，IgA腎病患者發(fā)生足細胞EMT。

4.足細胞EMT與腎病綜合征 腎病綜合征可由多種病因引起，主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥等臨床癥候群。足細胞特異性基因突變可能在腎病綜合征的發(fā)展中起重要作用。已證實，nephrin是足細胞的特殊功能蛋白，它的缺失會導致足細胞功能障礙性損傷，進一步導致足細胞EMT，并伴隨著蛋白尿和腎病綜合征的易感[32]。最早發(fā)現(xiàn)編碼sli膜蛋白nephrin(NPHS1)和podocin(NPHS2)的基因遺傳缺陷可致腎病綜合征，推測足細胞EMT與腎病綜合征有關，且足細胞EMT可能參與介導了腎病綜合征[33]。

五、足細胞EMT的防治藥物

足細胞損傷在腎小球硬化的發(fā)病機制中起核心作用。因此，靶向遏制足細胞損傷和穩(wěn)定足細胞數(shù)量的療法在一定程度上可減緩腎小球硬化的進展。目前，對足細胞EMT所致腎小球硬化的治療手段一般采取綜合治療。現(xiàn)用較多的防治藥物主要為新型化學類藥物、傳統(tǒng)中藥制劑和分子藥物。

1.化學類藥物 常用的化學類藥物包括免疫抑制劑、糖皮質激素類等。糖皮質激素可通過受體和非受體途徑穩(wěn)定細胞骨架、上調nephrin，進而保護足細胞免受損傷[34]。肝細胞生長因子(HGF)在腎臟間質細胞中表達，且與慢性腎纖維化中TGF-β1的表達呈負相關。體外和體內研究發(fā)現(xiàn)HGF特異性地抵消了TGF-β1的作用[35]，提示HGF對腎臟的保護作用與抑制足細胞EMT有關。有實驗發(fā)現(xiàn)，APX-115(ewha-18278)是一種新型口服Noxs抑制劑，可以保護2型糖尿病誘發(fā)的腎損傷[36]，APX-115治療的DN大鼠nephrin表達明顯比患病大鼠高，且α-SMA和Ⅳ膠原的蛋白表達被抑制，表明APX-115可以逆轉糖尿病足細胞損傷，改善足細胞EMT進展。

2.中藥制劑類 傳統(tǒng)中藥制劑在臨床上的應用也非常廣泛，如雷公藤內酯醇(triptolide，TP)，是從雷公藤中分離所得的一種二萜類化合物，可通過靶向轉錄因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶體等機制發(fā)揮抑制細胞增殖和促腫瘤細胞凋亡等抗腫瘤作用。大量體內外研究均證實，TP具有保護足細胞、抑制蛋白尿的作用，并可通過調節(jié)Smad信號途徑減輕腎臟纖維化程度[37]。TP通過有效抑制p53、p38和NFκB等信號通路，直接作用于足細胞，以減輕細胞凋亡、氧化應激等造成的損傷，從而保護足細胞。雷公藤制劑治療糖尿病腎病已在臨床上廣泛應用。糖腎平為中藥復方在防治DN的臨床應用中顯示出良好的療效。研究發(fā)現(xiàn)[38]，糖腎平能降低足細胞中TGF-β1、Smad2/3的表達，增加足細胞標志物CD2相關蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)表達，減少間質細胞標志物α-SMA，這些結果表明，糖腎平通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路的激活緩解足細胞EMT，維持足細胞形態(tài)功能的穩(wěn)定性，進而保證腎小球濾過屏障的完整性，減少蛋白尿的發(fā)生，減輕腎臟纖維化，這可能是其防治DN的作用機制之一。

3.分子藥物 隨著分子生物學熱潮的來臨，研究者更多的認識到其在機制研究及疾病防治中的重要位置。非編碼RNA，如lncRNA、miRNA參與各種生理和病理過程，最近的證據(jù)表明它們參與了上皮-間質化的過程。已知lncRNA ENSRNOG00000037522在DN足細胞EMT中起關鍵作用。通過小干擾RNA轉染使lncRNA ENSRNOG00000037522沉默或敲低lncRNA ENSRNOG00000037522可以通過調節(jié)α-SMA、nephrin的表達來修復足細胞的損傷[27]。lncC01619在足細胞細胞質中表達，并參與內質網(wǎng)應激信號通路。在DN大鼠模型中l(wèi)ncC01619下調，并導致足細胞損傷，而過表達lncC01619可減輕DN大鼠足細胞損傷改善腎功能[39]，同樣miR-27a已被證實通過DN中PPARγ/β-catenin信號傳導介導足細胞EMT，其在DN患者中表達上調，具有臨床和生物學意義。在DN大鼠中給予miR-27a抑制劑可逆轉足細胞EMT，并緩解腎功能[40]。以上研究均提示我們非編碼RNA在腎病患者足細胞EMT中扮演著重要的角色，其具備臨床和生物學意義，可作為足細胞EMT的潛在靶點。雖然類似的分子藥物暫時并沒有出現(xiàn)在臨床上，但其在整體動物水平具有良好的干預效果，相信在不久的以后，它們將會成為最安全有效的治療藥物。

六、結語

EMT是胚胎發(fā)育和組織修復中的重要機制。EMT參與介導疾病的進展，包括器官纖維化和癌癥。足細胞的損傷會使足細胞發(fā)生EMT，破壞腎小球的濾過屏障，引發(fā)蛋白尿，導致多種腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展。EMT是一個動態(tài)的轉變過程，引發(fā)EMT的信號通路有多種，對其中任一環(huán)節(jié)進行干預都有可能會誘發(fā)新的疾病或產生新的治療靶點，阻斷足細胞EMT可能成為更好的治療腎小球疾病的方案。尋找更早期且精準的靶點是今后要努力的方向。