韓淑華，黃見玲，曹丹丹，苑仁祥，劉丹丹，齊保龍

0 引言

小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）起源于支氣管神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，是肺癌中較為特殊的一種類型，占全球每年新發(fā)肺癌病例的15%～20%[1-2]。SCLC生長迅速，增殖率高，易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度在所有類型肺癌中最高。目前SCLC常用的臨床分期標準有AJCC/UICC的TNM分期及美國退伍軍人醫(yī)院的局限期（1imited disease,LD）/廣泛期（extensive disease,ED）兩種方法，LD對應TNM分期中的Ⅰ～Ⅲ期，ED對應Ⅳ期。對于晚期SCLC（Ⅲ期+Ⅳ期）患者，化療是主要的治療手段，標準的初始治療為順鉑或卡鉑聯(lián)合依托泊苷[3-4]，雖然早期能夠取得一定療效，但容易產(chǎn)生耐藥及復發(fā)，整體預后較差，目前仍缺乏評估化療療效及預后的生物學標志物。

DLL3是Notch信號通路的配體之一，在正常肺組織和肺鱗癌中無表達，但在80%以上的SCLC細胞表面可檢測到DLL3的表達，更重要的是DLL3在腫瘤起始細胞和耐藥腫瘤細胞中表達[5-7]，提示DLL3可能與SCLC復發(fā)及耐藥相關(guān)，但目前關(guān)于DLL3在SCLC中的表達與化療療效及預后的關(guān)系尚不清楚，本研究回顧性分析DLL3在晚期SCLC組織中的表達與晚期或轉(zhuǎn)移性SCLC一線含鉑化療療效的關(guān)系及其預測預后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年2月—2017年12月在東南大學附屬中大醫(yī)院首次診斷為Ⅲ/Ⅳ期SCLC并治療的64例患者，所有患者診斷均經(jīng)纖維支氣管鏡或肺穿刺活檢獲得病理確診。末次隨訪時間是2018年6月30日。其中男55例，女9例；中位年齡為66歲（44～89）歲，ECOG評分0～1分；78.1%（50/64）患者為吸煙者；按2017國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control,UICC）肺癌TNM分期分為：Ⅲ期23例，Ⅳ期41例。64例患者均完成2周期以上EP方案化療（順鉑：25 mg/(m2·d)×3和依托泊苷：100 mg/(m2·d)×3，每21天為一周期）；納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）肺部有可測量的病灶；（3）ECOG評分0～1；（4）預計生存時間≥2月；（5）具有足夠石蠟包埋組織。排除標準：（1）嚴重的心腦血管疾病、肝腎功能障礙和血液系統(tǒng)疾??；（2）合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤或肺轉(zhuǎn)移性腫瘤。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準（2018ZDSYLL089），組織標本收集及應用經(jīng)得患者及其家屬知情同意。

1.2 免疫組織化學檢測DLL3在晚期SCLC組織中的表達

兔抗DLL3多克隆抗體購自美國Abcam公司，羊抗兔二抗、即用型SABC試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司，DAB顯色液、檸檬酸鈉抗原修復液、蘇木精染液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要步驟：切取3 μm厚石蠟包埋組織，切片脫蠟水化，檸檬酸鈉抗原修復液修復20 min，3%H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS緩沖液沖洗，DLL3多克隆抗體按1:100稀釋后4℃過夜，生物素標記的二抗37℃孵育15 min，SABC 37℃孵育15 min，DAB染色，蘇木精對比染色，酒精脫水，中性樹膠封片。采用免疫組織化學染色結(jié)果半定量分析計數(shù)系統(tǒng)，根據(jù)陽性細胞百分率（percentage of positive cells,PPC）和染色強度（staining intensity,SI）綜合計分進行結(jié)果判定。其中染色強度：無染色為0分、弱染色為1分、中等染色為2分、強染色為3分，陽性細胞的百分率：無陽性細胞為0分、＜10%陽性細胞為1分、10%～50%陽性細胞為2分、≥50%～80%陽性細胞為3分、≥80%陽性細胞為4分，以兩者乘積免疫組織化學總分（immuno-reactive sum score,IRS）進行分組，即IRS=SI×PPC，IRS≥6分為高表達組（DLL3-high），＜6分為低表達組（DLL3-low）。

1.3 療效評估

按照實體腫瘤的療效評價標準1.1（RECIST 1.1），每2周期化療后進行療效評估。包括完全緩解（complete response,CR）、部分緩解(partial response,PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）和疾病進展（progressive disease,PD），CR或PR的患者4周后再確認療效。有效率（response rate,RR）=（CR+PR）/總病例數(shù)×100%。疾病控制率（disease control rate,DCR）=（CR+PR+SD）/總病例數(shù)×100%。預后分析指標：無進展生存期（progression-free survival,PFS）定義為從首次診斷至疾病進展或最后一次隨訪的時間?？偵嫫冢╫verall survival,OS）定義為從首次診斷到死亡或最后一次隨訪的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。DLL3表達與臨床特征、化療療效的相關(guān)性采用χ2檢驗，應用Kaplan-Meier方法進行單因素生存分析，Log rank檢驗差異性，Cox比例風險回歸模型進行預后多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DLL3表達與臨床特征的關(guān)系

全組64 例晚期SCLC患者中，有54 例（84.1%）患者DLL3表達陽性，其中DLL3低表達（0＜IRS＜6）34例（54.7%）；DLL3高表達（IRS≥6）20例（29.7%），10例無陽性表達（IRS=0）。陽性表達為細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，見圖1。根據(jù)1.2分組標準，最終10例無表達患者與34例IRS＜6分的低表達患者被分至DLL3-low組（n=44），20例IRS≥6分的患者被分至DLL3-high組（n=20）。DLL3表達與患者性別、年齡、分期、腫瘤大小無相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

圖1 DLL3在晚期SCLC組織中的表達 (×200)Figure 1 DLL3 expression in advanced SCLC tissues (×200)

表1 DLL3在晚期SCLC中的表達與臨床特征的關(guān)系 (n)Table 1 Relation between DLL3 expression and clinical parameters of advanced SCLC patients (n)

2.2 DLL3表達與化療反應率及預后的關(guān)系

對患者化療療效分析顯示，DLL3高表達組CR 0例，PR 6例（30.0%），SD 4例（20.0%）和PD 10例（50.0%），RR為30.0%，DCR為50.0%。DLL3低表達組中，CR 1例（2.3%），PR 29例（65.9%），SD 7例（15.9%）和PD 7例（15.9%），RR為68.2%，DCR為84.1%。DLL3低表達組化療有效率及疾病控制率均高于高表達組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.145,P=0.006;χ2=8.192,P=0.007）。DLL3高表達組患者的PFS為4.9月，DLL3低表達組為7.0月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.025），見圖2A；DLL3高表達患者中位OS為13.0月，DLL3低表達患者中位OS為16.6月，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.071），見圖2B。單因素生存分析結(jié)果顯示，DLL3表達、腫瘤分期及腫瘤直徑是影響PFS的重要因素，腫瘤分期是影響OS的重要因素，見表2、3。Cox多因素分析結(jié)果顯示，DLL3低表達、腫瘤分期早、腫瘤直徑＜5 cm是晚期SCLC患者PFS的獨立預后因素，腫瘤分期是OS的獨立預后因素。

圖2 DLL3的表達與晚期SCLC患者無進展生存期(A)及總生存期(B)的關(guān)系Figure 2 Relation between DLL3 expression and PFS(A),OS(B) of advanced SCLC patients

表2 單因素分析晚期SCLC患者臨床特征與無進展生存期及總生存期的關(guān)系Table 2 Univariate analysis of relation between clinical characteristics and PFS,OS of patients with advanced SCLC

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，全球發(fā)病率居惡性腫瘤的首位，每年肺癌相關(guān)死亡人數(shù)超過100萬，嚴重威脅人類的生命健康[2]。其中小細胞肺癌惡性程度在所有類型肺癌中最高[1]，多數(shù)患者在初診時即有遠處轉(zhuǎn)移，一般不適合手術(shù)治療，SCLC對化療及放療敏感，但很快會出現(xiàn)耐藥而導致病情進展。SCLC一線治療主要依賴于含鉑化療，例如卡鉑/順鉑聯(lián)合依托泊苷或伊立替康[1]。雖然SCLC對一線治療的反應率很高（50%～70%），但仍有部分患者化療療效差，鑒于化療存在骨髓抑制、肝腎功能損傷等可影響患者生活質(zhì)量的不良反應，因此尋找可能預測化療療效的相關(guān)標志物有助于幫助臨床醫(yī)生評估化療的必要性，為患者制定個體化治療方案。

表3 Cox回歸多因素分析晚期SCLC患者臨床特征與無進展生存期及總生存期的關(guān)系Table 3 Multivariate Cox prognosis analysis of relation between clinical characteristics and PFS,OS of patients with advanced SCLC

DLL3作為Notch信號通路的抑制性配體，已在部分腫瘤中證實具有促進腫瘤增殖的作用。過表達DLL3能夠促進人胃癌及肺腺癌細胞增殖，抑制其凋亡[7-8]。下調(diào)DLL3表達后腫瘤細胞生長受到顯著抑制[9]。SCLC中DLL3可能在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞形成中發(fā)揮重要作用[10-11]。多項研究證實DLL3在SCLC腫瘤組織中高表達，而在正常肺組織中不表達[6-7,12]。在本試驗中，我們采用免疫組織化學的方式檢測了DLL3在晚期SCLC組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在84.1%的晚期SCLC腫瘤組織中可檢測到DLL3的表達，定位于細胞膜，且表達水平與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、腫瘤大小均無相關(guān)性，與以往文獻結(jié)果一致[6]。結(jié)果表明DLL3表達情況可能影響SCLC對EP方案化療的敏感度。另外DLL3在晚期SCLC腫瘤組織中的表達水平與患者的PFS相關(guān)，DLL3高表達組患者的PFS較低表達組縮短。這也間接證實DLL3能夠影響SCLC患者對化療的敏感度，可能的機制是DLL3參與化療耐藥的形成。首先DLL3在SCLC腫瘤起始細胞（tumor initiating cells,TICs）中表達，而TICs與腫瘤耐藥能力具有密切關(guān)系[13]。Saunders等[5]進行全轉(zhuǎn)錄組測序以鑒定活檢或手術(shù)切除SCLC和LCNEC腫瘤細胞中差異表達的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有患者TICs中可檢測到DLL3基因的表達，而抗DLL3靶向抗體-藥物偶聯(lián)物Rovalpituzumab teserine（Rova-T; SC16LD6.5）能夠根除SCLC和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中的TICs[5]，提示DLL3可能在維持TICs生物學功能中發(fā)揮重要作用。其次，DLL3調(diào)控上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）進程[14]，EMT與腫瘤化療耐藥關(guān)系密切，發(fā)生EMT的腫瘤細胞可獲得凋亡抵抗，逃逸順鉑的細胞毒作用，產(chǎn)生對順鉑耐藥[15-17]。再者，DLL3能夠激活P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路[18]，這是目前證實與腫瘤細胞化療抵抗相關(guān)的一條通路[19]。但目前尚無關(guān)于DLL3與化療耐藥直接關(guān)系的報道，需要更多的研究來驗證兩者的關(guān)系。對于DLL3與腫瘤預后的關(guān)系，文獻報道在NSCLC、小細胞膀胱癌及子宮內(nèi)膜癌中，DLL3高表達患者相對于低表達者預后差，即DLL3高表達提示不良預后[20-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)DLL3影響晚期SCLC患者的PFS，但對OS無顯著影響，可能的原因是：（1）我們檢測DLL3表達時采用的是免疫組織化學的方法，此方法為半定量分析方法，且受實驗者技術(shù)水平的影響，結(jié)果判斷方面也具有一定的主觀性。（2）SCLC患者的預后受多種因素的影響，且存在個體差異性，部分患者可能為非腫瘤性死亡，影響了最終結(jié)果的判斷。（3）本研究為回顧性研究，隨訪過程中部分患者失訪，部分患者截至隨訪日期時仍存活，總體失訪率達到10.9%。因此，需要更多的前瞻性、多中心、大樣本的臨床試驗進一步驗證本試驗結(jié)果。另外單一標志物用于療效及預后預測具有一定的局限性，而在某些研究中提到甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）單一指標不能用來預測SCLC預后，但DLL3與TTF-1聯(lián)合卻是SCLC的獨立預后指標（P=0.001），能很好預測SCLC的預后[22-23]，后期可研究多個標志物聯(lián)合的預測價值。有研究報道，血清胃泌素釋放肽前體（ProGRP）在對于SCLC具有較高的療效評價價值，而神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）能夠較好的判斷預后[24-25]，未來可將這些標志物聯(lián)合DLL3應用于療效評價及預后評估，做到優(yōu)勢互補，為臨床醫(yī)生制定個體化治療方案及更好評估病情提供幫助。

綜上，DLL3表達與晚期SCLC患者化療反應率和PFS呈負相關(guān)，DLL3可能是預測SCLC化療敏感度及預后的生物學標志物，進一步研究其與化療耐藥的相關(guān)性可能為SCLC的治療提供新的思路。DLL3高表達與低表達患者OS差異無統(tǒng)計學意義，提示DLL3表達對于晚期SCLC患者的長遠預后無預測價值。