齊曉光，祁春艷，秦博宇，胡毅，韓為東

0 引言

肺癌作為目前國際、國內(nèi)最常見的腫瘤之一，已經(jīng)成為影響公共健康的重要社會及醫(yī)學(xué)熱點問題；其中肺腺癌是肺癌最常見的病理類型。最近，隨著免疫治療的應(yīng)用，尤其是程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）單抗的應(yīng)用，給晚期肺腺癌帶來了新的突破及希望。然而，在免疫治療療效預(yù)測方面中，目前廣泛認(rèn)為PD-L1表達(dá)水平可以作為肺腺癌帕博利珠單抗的療效預(yù)測指標(biāo)，但是在臨床實踐中單純依靠PD-L1表達(dá)水平來預(yù)測能否從免疫治療中獲益存在一定的局限性。而新型的療效預(yù)測標(biāo)志物，比如腫瘤突變負(fù)荷等，在預(yù)測免疫治療的療效方面還存在一定的爭議，提示尋找新的免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物是目前精準(zhǔn)免疫治療迫切需要解決的問題。

近年來隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，全基因組測序日愈成熟，那么對于免疫治療持續(xù)臨床獲益的患者與未能獲益的患者之間的基因突變譜特征方面，是否存在差異及其這些差異基因突變譜能否成為預(yù)測療效的新的生物標(biāo)志物等問題，值得進(jìn)一步研究。本研究正是基于此出發(fā)點，探索帕博利珠單抗在肺腺癌免疫治療中持久臨床獲益關(guān)鍵基因突變譜的篩選及相關(guān)信號通路分析。

1 資料與方法

1.1 肺腺癌基因突變數(shù)據(jù)集篩選

在TCGA數(shù)據(jù)庫檢索肺腺癌與免疫治療相關(guān)數(shù)據(jù)集，共篩選到三個數(shù)據(jù)集，包括Lu ng Adenocarcinoma（MSKCC,Science 2015）、Nonsmall Cell Lung Cancer（MSK,Cancer Cell 2018）和Non-small Cell Lung Cancer (MSKCC,J Clin Oncol 2018)，按照如下納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）晚期肺腺癌患者；（2）免疫治療均為帕博利珠單抗單藥治療；（3）評估標(biāo)準(zhǔn)采用ir-RECIST（immune-related response evaluation criteria in solid tumors,ir-RECIST）標(biāo)準(zhǔn)；（4）臨床指標(biāo)定義：應(yīng)用免疫治療無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）超過6個月為持久臨床獲益組（durable clinical benefit,DCB），反之定義為非持久臨床獲益組（non-durable clinical benefit,Non-DCB）；（5）全外顯子測序。剔除標(biāo)準(zhǔn)：PD-1聯(lián)合CTLA-4單抗數(shù)據(jù)集（MSK,Cancer Cell 2018），其他的PD-1單抗及PD-L1單抗治療患者（MSKCC,J Clin Oncol 2018）；肺鱗癌等其他病理類型肺癌患者；經(jīng)篩選選定Lung Adenocarcinoma（MSKCC,Science 2015）為研究對象，該數(shù)據(jù)集共35例患者，剔除1例未做基因突變測序分析患者及隨訪未超過6個月無法評估的3例，共31例患者納入研究，其中Non-DCB組17例，DCB組14例。同時分析兩組患者基線特征，并進(jìn)一步分析兩組之間在PD-L1表達(dá)、突變負(fù)荷及其PFS等方面的不同，為后續(xù)進(jìn)一步篩選基因突變譜的差異奠定臨床理論基礎(chǔ)。

1.2 差異基因的篩選

下載數(shù)據(jù)集肺腺癌患者臨床特征資料，同時下載兩組患者全基因組或全外顯子組基因突變情況，將所有樣本中基因突變頻率在10%以上的基因突變譜情況納入研究分析，根據(jù)療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，探索DCB組和Non-DCB組基因突變特征的差異，并利用韋恩圖在線分析軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），對兩組進(jìn)行差異基因突變譜分析，篩選并比較兩組患者之間在基因突變特征方面的不同。

1.3 基因功能注釋與通路富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）生物信息學(xué)分析軟件，篩選以人為分析對象的研究，對DCB組患者基因突變差異基因，進(jìn)行基因本體論（gene ontology,GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集通路分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因的篩選

先采用String在線軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl），分析DCB組中差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，剔除孤立節(jié)點，下載蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果；再將互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)一步分析，該軟件是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件。本研究采用Cytoscape 3.7.2版本，對于DCB組中的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析；并應(yīng)用cytoHubba插件，采用Closeness算法，篩選能夠預(yù)測肺腺癌免疫治療通路中的關(guān)鍵核心基因。

1.5 關(guān)鍵核心基因與預(yù)后分析

GEPIA是一個腫瘤數(shù)據(jù)挖掘網(wǎng)站，數(shù)據(jù)來源主要基于TGCA和GTEx數(shù)據(jù)庫。本研究通過GEPIA在線生存分析工具（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php），分析核心基因表達(dá)水平與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系，并繪制生存曲線。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征分析

患者基線特征分析顯示，患者在年齡、性別、吸煙病史等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。DCB組具有更高的PD-L1表達(dá)及基因突變負(fù)荷（96.47±24.87vs.236.50±46.60,t=2.784），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009）。

表1 31例晚期持久臨床獲益與非持久臨床獲益肺腺癌患者基線特征分析Table 1 Characteristics of 31 advanced lung adenocarcinoma patients between DCB group and Non-DCB group

2.2 兩組患者PFS的比較

結(jié)果顯示，DCB組的PFS明顯優(yōu)于non-DCB組，且兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=33.00,P＜0.0001），見圖1。

圖1 DCB組與Non-DCB組之間PFS的比較Figure 1 Comparison of PFS between DCB group and Non-DCB group

2.3 兩組患者差異基因突變譜情況

帕博利珠單抗在肺腺癌治療中，基因突變譜在DCB組和Non-DCB組之間存在差異，對所有樣本中基因突變頻率20%以上的基因突變譜進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)DCB組中更常見基因突變譜包括：FLNC、CRB2、KRAS、MUC4、TNRC18、CSMD3等基因。運用韋恩圖展示兩組之間差異基因突變譜情況，見圖2。

2.4 GO功能注釋分析及KEGG通路富集分析

圖2 DCB組與Non-DCB組基因突變差異譜Figure 2 Differential genes mutation signature between DCB group and Non-DCB group

Gene Ontology可分為分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological process）和細(xì)胞組分（cellular component）三個部分。在分子功能方面，包括核酸綁定、GTPase激活活動、跨膜信號受體活性、受體的活動、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、腺苷三磷酸酶活性等方面；在生物學(xué)過程方面，包括細(xì)胞增殖、多細(xì)胞生物的發(fā)展、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，DNA模板化、GTPase活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、嗜同性細(xì)胞通過質(zhì)膜黏附分子黏附等；在細(xì)胞組分分析中，包括細(xì)胞膜的組成部分、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞表面、樹突、微管、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等方面，見圖3。

通過KEGG通路富集分析提示，這些候選基因主要參與了ECM受體交互作用，Ca2+通道、Rap1、PI3K-Akt信號通路等，提示這些信號通路可能為肺腺癌免疫治療中的關(guān)鍵通路。同時通過KEGG Chord作圖分析各個差異基因在各個通路中的分布情況，見圖3。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析

通過String在線分析軟件，DCB組中的1153個差異基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，剔除孤立節(jié)點，并下載蛋白互作結(jié)果文件；再將蛋白互作文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，采用cytoHubba插件，進(jìn)一步分析互作網(wǎng)絡(luò)中的潛在關(guān)鍵基因。結(jié)果顯示，基于Closeness算法，其中節(jié)點度最高的6個基因為：KRAS（Degree=245.402381）、PPP2CB（Degree=229.0595238）、CDC20（Degree=221.9880952）、DYNCLI2（Degree=218.447619）、BRCA1（Degree=217.2309524）、AKAP9（Degree=214.8595238），見圖4、表2。

2.6 關(guān)鍵基因的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系

圖3 DCB組GO功能及KEGG富集分析Figure 3 GO function and KEGG pathway enrichment in DCB group

圖4 DCB組中蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Figure 4 PPI networks of hub genes in DCB group

表2 基于Closeness算法評分最高的6個核心關(guān)鍵基因Table 2 Top 6 hub genes ranked by Closeness method

利用GEPIA在線分析軟件，首先分析了這6個核心基因在肺腺癌及其癌旁正常組織的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CDC20在肺腺癌中表達(dá)高于其癌旁正常組織，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其他關(guān)鍵核心基因未見表達(dá)差異；其次，分析這6個核心基因與臨床分期關(guān)系，結(jié)果顯示，CDC20、DYNC1I2、BRCA1等表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。最后，進(jìn)一步分析6個關(guān)鍵核心基因與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，CDC20、BRCA1等高表達(dá)組的中位總生存時間明顯短于低表達(dá)組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。KRAS、PPP2CB、DYNC1I2、AKAP9等高表達(dá)組與低表達(dá)組之間中位總生存之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

3 討論

腫瘤的免疫治療，主要是通過激活人體自身抗腫瘤的免疫功能來殺死腫瘤細(xì)胞，具有療效持久、不良反應(yīng)小的特點[1]，被諸多醫(yī)學(xué)科學(xué)家寄予厚望。目前臨床應(yīng)用較多的是PD-1、PD-L1、CTLA-4單抗等藥物[2]，在肺癌的研究中，PD-1單抗已被批準(zhǔn)用于晚期肺癌一線、二線等治療[3-4]。本研究主要涉及帕博利珠單抗在肺腺癌中的療效預(yù)測相關(guān)生物標(biāo)志物分析。目前除了PD-L1可以比較明確地作為帕博利珠單抗免疫治療療效預(yù)測生物標(biāo)志物之外[5]，其他的療效預(yù)測標(biāo)志物，如腫瘤突變負(fù)荷、新抗原、人類白細(xì)胞抗原等新型生物標(biāo)志物[6-8]能否有效指導(dǎo)免疫治療尚存在爭議，所以尋找新的療效相關(guān)生物標(biāo)志物是當(dāng)前急需解決的臨床難題之一。本研究正是基于此出發(fā)點，探索相對于帕博利珠單抗治療療效不佳的Non-DCB組而言，能否通過生物信息學(xué)分析DCB組的基因突變譜情況，進(jìn)而更好的指導(dǎo)帕博利珠單抗治療。

本研究結(jié)果顯示，在帕博利珠單抗用于肺腺癌的治療中，基因突變譜在DCB組和Non-DCB組之間存在差異，DCB組中肺腺癌患者具有更多的基因突變數(shù)量，更多的突變負(fù)荷及更長的PFS等。既往研究顯示，具有更多突變負(fù)荷的肺癌患者，其免疫治療的療效會相對更好[8]，與我們的研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步尋找更具普遍性的基因突變特征，對樣本中突變頻率20%以上的基因突變譜進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)DCB組中更常見基因突變譜包括：FLNC、CRB2、KRAS、MUC4、TNRC18、CSMD3等基因突變，提示臨床工作中，結(jié)合全基因組分析，不同的分子突變特征有助于進(jìn)一步指導(dǎo)并提高肺腺癌免疫治療的療效。

為進(jìn)一步分析肺腺癌患者應(yīng)用帕博利珠單抗治療獲益的可能機(jī)制，本研究應(yīng)用在GO及KEGG富集通路分析，結(jié)果分析顯示，獲益人群中的突變譜基因，主要參與了跨膜信號受體活性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖的調(diào)控、激酶的活性調(diào)節(jié)、Ca2+通道信號通路、Rap1通路、PI3K-Akt通路等生物學(xué)行為及通路；提示這些生物學(xué)功能及信號通路可能在肺腺癌免疫治療通路中起到關(guān)鍵作用，但其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步基礎(chǔ)實驗驗證。

圖5 肺腺癌中6個關(guān)鍵核心基因與臨床分期及預(yù)后的關(guān)系Figure 5 Relation between hub genes and pathological staging,prognosis of lung adenocarcinoma

通過Cytoscape軟件分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖形，篩選了DCB組中6個關(guān)鍵核心基因。進(jìn)一步對這些核心基因與肺腺癌的預(yù)后的關(guān)系研究提示，CDC20和BRCA1等的高表達(dá)是肺腺癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志物。

已有多項研究提示CDC20的高表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，包括前列腺腫瘤、肉瘤，乳腺癌等，其機(jī)制可能是參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲等生物學(xué)過程[9-12]，Zhang等在吸煙相關(guān)肺癌研究中發(fā)現(xiàn)CDC20的高表達(dá)與肺癌的預(yù)后相關(guān)[13]，Yi等亦發(fā)現(xiàn)CDC20在肺癌中表達(dá)明顯上調(diào)，其主要的突變形式是基因擴(kuò)增，更重要的是，該基因的過表達(dá)與肺癌患者更短的生存期有關(guān)[14-15]。這些研究均與我們當(dāng)前的研究結(jié)果一致。Budczies等研究發(fā)現(xiàn)，CDC20是癌癥免疫反應(yīng)中的潛在藥物靶點[16]，對這些靶點深入研究，有望提高免疫治療的精準(zhǔn)化。也在一定程度上提示，CDC20在肺癌免疫治療的相關(guān)通路中起到了重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因既往研究主要集中在胚系突變研究中，結(jié)果顯示，伴有BRCA1基因突變的女性患者更容易發(fā)生胰腺腫瘤、乳腺癌、卵巢癌等[17-21]，且對于伴有BRCA1突變患者，應(yīng)用奧拉帕利靶向治療，具有很好的靶向藥物指導(dǎo)作用。而在本研究中，結(jié)果提示，對于肺腺癌患者，BRCA1高表達(dá)患者，具有更差的預(yù)后；Wang等研究提示[18]，其可能的機(jī)制是通過TGF-β/PI3K/AKT/mTOR等信號通路參與了腫瘤的增殖及侵襲等生物學(xué)過程。但是對于kras基因突變問題，既往研究中提示為肺癌的預(yù)后不良生物標(biāo)志物[22]，與本研究結(jié)果不一致，其可能的原因一是研究樣本的選擇及樣本量的不同，二是預(yù)后分析軟件及算法等統(tǒng)計學(xué)方面的差異。

另外，本研究一個局限性在于樣本量偏少，其主要原因在于，檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，共檢索肺腺癌免疫療效預(yù)測的三個數(shù)據(jù)集，包括MSKCC,Science 2015,MSK,Cancer Cell 2018和MSKCC,J Clin Oncol 2018，但是MSK,Cancer Cell 2018數(shù)據(jù)集包含了鱗癌，免疫治療藥物是PD-1單抗聯(lián)合CTLA-4單抗；另外，MSKCC,J Clin Oncol 2018數(shù)據(jù)集也包括了鱗癌及其他類型，治療中除了含有帕博利珠單抗外，還包括納武單抗及PD-L1單抗等。為了排除不同的PD-1單抗及免疫聯(lián)合之間的效應(yīng)差別，本研究只納入統(tǒng)一MSKCC,Science 2015，統(tǒng)一的帕博利珠單抗及肺腺癌患者。所以某種程度上，是為了研究的嚴(yán)謹(jǐn)性，本研究排除了病理類型、治療藥物、免疫單藥還是聯(lián)合治療等的差異，同時選擇全外顯子測序，由于受到研究設(shè)計的影響，導(dǎo)致納入研究的肺腺癌樣本量偏少。

總之，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)挖掘分析提示，在免疫治療不同臨床療效的患者人群中，在基因突變譜及特征方面存在差異，進(jìn)一步研究臨床獲益人群的基因突變譜特征分析，為肺腺癌新的分子分型提供了一定的理論支撐。另外，在通路富集分析及關(guān)鍵基因篩選方面，初步篩選了參與重要免疫調(diào)節(jié)通路的潛在關(guān)鍵基因，有助于進(jìn)一步加深對免疫治療的理解，從而更好地對肺腺癌患者進(jìn)行精準(zhǔn)化、個體化治療。