劉銳，堅(jiān)彩明，孫興，王瑩，杜娟，米志寬，趙菊梅

0 引言

2018年有209萬新發(fā)肺癌病例和176萬人死于肺癌[1]。在我國，全性別癌癥死亡第一位的就是肺癌[2]。目前對于肺癌的治療有多種方法，安全性和患者生存質(zhì)量均有所提升，但總體生存率仍處于較低水平。有研究表明，3098例Ⅳ期NSCLC患者手術(shù)切除治療后的5年生存率是21.1%[3]。免疫治療可將晚期NSCLC患者5年生存率提升數(shù)倍[4]，所以認(rèn)為免疫治療可為患者帶來更多獲益。提高患者機(jī)體抗腫瘤免疫水平，改善治療效果，是目前較為關(guān)注的一種治療方法。β防御素-2（beta defensin-2,MBD2）可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，使其從幼稚轉(zhuǎn)化為成熟[5]，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能。水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）基質(zhì)蛋白（matrix protein,MP）在病毒引起的細(xì)胞凋亡中起著主導(dǎo)作用[6]，研究表明，VSVM誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制是抑制宿主基因的表達(dá)[7]，且其在線粒體凋亡途徑中也發(fā)揮著作用[8]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建MBD2和VSVM的共表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至肺癌LL/2細(xì)胞中，探討MBD2聯(lián)合VSVM對肺癌細(xì)胞增殖的影響及其體外DC細(xì)胞趨化活性，為肺癌免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 肺癌LL/2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pVITRO2-VSVM、pVITRO2-MBD2及pVITRO2-VSVM-MBD2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑、試劑盒 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Triton X-100、牛血清白蛋白和羊抗兔IgG購自美國Sigma公司；β防御素-2（兔來源）、GAPDH（兔來源）購自英國Abcam公司；青霉素和鏈霉素購自北京悅康凱悅制藥有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和AnnexinV-PE/7-ADD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 CKX41倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；-80℃低溫冰箱購自日本Panasonic公司；蛋白電泳設(shè)備、恒壓、恒流電泳儀和冷凍離心機(jī)購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞 復(fù)蘇肺癌LL/2細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2及濕度飽和的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時(shí)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 收集生長狀態(tài)良好的LL/2細(xì)胞，接種于96孔或6孔培養(yǎng)板，待對數(shù)生長期時(shí)采用脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。參照說明書制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物，吹打混勻，孵育20 min。待LL/2細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，棄去完全培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物37℃培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后換用新鮮完全培養(yǎng)基，分別轉(zhuǎn)入pVSVM、pMBD2、pVSVM+pMBD2、pVSVM-MBD2，另設(shè)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和空白對照組。綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pVITRO2-GFP）作為參照，觀察綠色熒光的表達(dá)情況以判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測目的基因MBD2及VSVM的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)所用VSVM、MBD2cDNA 序列信息由NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=）搜索獲得，VSVM和MBD2的RT-PCR引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)UCSC Genome Browser模擬檢測及RTPCR預(yù)檢測正確后使用。引物序列為VSVM-F:5'-CGATTGAGCTCACAATGACC-3'；VSVM-R:5'-ATCAGGCCAAACATTAAGGC-3'；MBD2-F:5'-CACCAATGGAGGGTACTGTG-3'；MBD2-R:5’-GGGTTCTTCTCTGGGAAACA-3’。RT-PCR按照TaKaRa公司的RT-PCR檢測試劑說明書提取LL/2細(xì)胞總RNA。RT-PCR進(jìn)行定量分析，據(jù)檢測結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參基因（β-actin-F:5'-CCCAGGCATTGCTGACAGG-3'；β-actin-R:5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'），采用2-ΔΔCt=[（Ct目的基因-Ct質(zhì)控）sample A-（Ct目的基因-Ct質(zhì)控）sample B)]分析各基因的相對表達(dá)量變化。

1.2.4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MBD2蛋白水平的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的LL/2細(xì)胞，PBS洗滌，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA分析測定蛋白質(zhì)濃度。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每個(gè)蛋白質(zhì)樣品20～40 μg，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉稀釋一抗，將膜放入4℃冰箱孵育過夜，同樣方法稀釋二抗室溫孵育2 h，在暗室中進(jìn)行ECL檢測，觀察條帶情況。

1.2.5 MTT法檢測各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對肺癌LL/2細(xì)胞生長的抑制作用 倒置顯微鏡觀察LL/2細(xì)胞，將對數(shù)生長期細(xì)胞用PBS洗滌，加入1 ml的胰酶消化液至細(xì)胞變圓，加入2 ml的DMEM培養(yǎng)基至瓶底細(xì)胞全部脫落終止，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升，按每孔200 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱待細(xì)胞生長至70%～90%時(shí)，按照上述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36、48、60和72 h時(shí)，取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μl配置的5 mg/ml MTT溶液，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)板，吸取上清液，加入DMSO 150 μl振蕩混勻，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度值，重復(fù)三次取平均值，計(jì)算不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，LL/2細(xì)胞的生長抑制率。

1.2.6 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對肺癌細(xì)胞LL/2凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 當(dāng)LL/2細(xì)胞生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)期時(shí)處理細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè)/毫升，每孔2 ml接種于六孔板，采用上述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后36、48、72 h取出培養(yǎng)板，PBS洗滌，PI染液至覆蓋蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別重復(fù)三次。

1.2.7 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對細(xì)胞凋亡率的影響 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染方法同1.2.6，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h取出，嚴(yán)格按照說明書操作制成濃度為1×106個(gè)/毫升單細(xì)胞懸液，吸取100 μl的重懸液到流式管中，加入5 μl Annexin V-PE混勻后避光孵育5 min，加入10 μl 20 μg/ml的7-AAD（核酸染料），并加入400 μl PBS，立即行流式細(xì)胞術(shù)檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 MBD2趨化活性檢測 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集上清液，調(diào)整DC濃度為5×106個(gè)/毫升。加入DC細(xì)胞懸液于transwell小室上層，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，收集上清液置于下層，孵育16 h。吸棄上層液體，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LL/2細(xì)胞效率

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h開始表達(dá)綠色熒光蛋白，48 h達(dá)到較高表達(dá)，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)量可達(dá)80%，提示我們轉(zhuǎn)染方法及質(zhì)粒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá) 80%以上，見圖1。

2.2 RT-PCR檢測各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組目的基因表達(dá)

圖1 pGFP轉(zhuǎn)染LL/2細(xì)胞48h后GFP表達(dá)量Figure 1 GFP expression in LL/2 cells after pGFP transfection for 48h

與空白對照組相比，pVSVM、pVSVM+pMBD2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及pVSVM-MBD2轉(zhuǎn)染組中，均可檢測到VSVM基因的表達(dá)；pMBD2、pVSVM+pMBD2及pVSVM-MBD2轉(zhuǎn)染組，均可檢測到MBD2基因的表達(dá)，表明各重組質(zhì)粒在LL/2細(xì)胞中均能表達(dá)目的基因，見圖2。

圖2 LL/2細(xì)胞中目的基因mRNA相對表達(dá)量Figure 2 Relative expression of target gene mRNA in LL/2 cells

2.3 Western blot檢測細(xì)胞重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后LL/2細(xì)胞MBD2蛋白水平的表達(dá)

在空白對照組、pVITRO2-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞及pVSVM轉(zhuǎn)染組均未檢測到MBD2表達(dá)；而轉(zhuǎn)染pMBD2及pVSVM-MBD2質(zhì)粒組總蛋白中檢測到MBD2的表達(dá)，表明重組質(zhì)?？稍诜伟㎜L/2細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，見圖3。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)分析重組質(zhì)粒對LL/2細(xì)胞生長的抑制作用

pVSVM、pVSVM+pMBD2共轉(zhuǎn)染和pVSVMMBD2雙表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LL/2細(xì)胞，有明顯生長抑制作用，且pVSVM-MBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制更明顯，與單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F36=475.6,P36＜0.001；F48=541.0,P48＜0.001;F60=1191.0,P60＜0.001;F72=613.4,P72＜0.001），而pMBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制作用不明顯，見圖4。

圖3 Western blot檢測MBD2在各處理組LL/2細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 MBD2 expression in LL/2 cells of each treatment group detected by Western blot

2.5 PI熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化

空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的LL/2細(xì)胞生長良好、胞質(zhì)豐富、細(xì)胞核明顯、細(xì)胞密度較高，生長速度快于其他轉(zhuǎn)染組；而pVSVM、pVSVM+pMBD2共轉(zhuǎn)染及pVSVM-MBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞密度較小，出現(xiàn)體積變小、變圓、核固縮等凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，與之相比，空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和pMBD2轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，見圖5。

2.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

空白對照組凋亡率為（4.82±0.21）%，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組凋亡率為（7.85±1.35）%，pMBD2轉(zhuǎn)染組凋亡率為（21.6±2.03）%，pVSVM轉(zhuǎn)染組凋亡率為（30.81±2.26）%；pMBD2+pVSVM轉(zhuǎn)染組凋亡率為（31.80±3.02）%；pVSVM-MBD2轉(zhuǎn)染組凋亡率為（56.30±4.31）%。各組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=164.3,P＜0.001），進(jìn)一步進(jìn)行各轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較，細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t脂質(zhì)體=3.841,P脂質(zhì)體=0.0184;tpMBD2=14.24,tpVSVM=19.83,tpMBD2+pVSVM=15.44,tpMBD2-pVSVM=20.66,均P＜0.05），見圖6。

圖4 重組質(zhì)粒對LL/2細(xì)胞增殖的影響Figure 4 Effect of recombinant plasmids on proliferation of LL/2 cells

2.7 MBD2趨化活性檢測

各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后趨化活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=212.7,P＜0.001）。進(jìn)一步比較Lip2000與pMBD2、pVSVM-MBD2質(zhì)粒間的趨化能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tpMBD2=18.07,tpVSVM-MBD2=17.24,P＜0.001）；比較pVSVM與pMBD2、pVSVMMBD2質(zhì)粒之間的趨化能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tpMBD2=17.97,t pVSVM-MBD2=17.13,P＜0.001）；比較pMBD2和pVSVM-MBD2質(zhì)粒之間的趨化能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.413,P=0.027,P＜0.05），見圖7。

圖5 LL/2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PI染色檢測細(xì)胞核形態(tài)Figure 5 Nuclear morphology of LL/2 cells after transfection detected by PI staining

圖6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡Figure 6 Cell apoptosis detected by flow cytometry

圖7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LL/2細(xì)胞后對DC的趨化作用Figure 7 Chemotaxis of DC after plasmid transfection of LL/2 cells

3 討論

目前腫瘤的免疫治療備受關(guān)注，正在成為研究熱點(diǎn)。在惡性腫瘤的治療中，腫瘤免疫治療已經(jīng)取得了重大突破[9-11]。機(jī)制為通過激發(fā)機(jī)體免疫功能，提高機(jī)體的抗腫瘤作用，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。本研究中，MBD2是天然免疫分子，參與機(jī)體的天然免疫應(yīng)答。先前已被證明小鼠MBD2誘導(dǎo)骨髓源性iDC成熟的機(jī)制是作為內(nèi)源性配體與Toll樣受體4直接作用，β-防御素能與MIP-3a（小鼠巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)蛋白）競爭，抑制它與抗體CCR6轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合，趨化誘導(dǎo)幼稚DC細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，促使免疫應(yīng)答的發(fā)生，提示MBD2可能在機(jī)體的免疫監(jiān)視中發(fā)揮作用，可將其用于腫瘤免疫治療。細(xì)胞凋亡是一種自主有序的死亡，這一過程的紊亂往往會(huì)誘發(fā)許多疾病。有研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是腫瘤治療的關(guān)鍵[12]，提示我們可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡來進(jìn)行抗癌治療。本研究中，VSV是一種溶瘤病毒（OV），其基質(zhì)蛋白是主要的致毒因素，VSVM可通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。

本研究結(jié)果顯示，pVSVM、pVSVM+pMBD2雙質(zhì)粒與pVSVM-MBD2融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)變化明顯，鏡下觀察到細(xì)胞體積變小、變圓及核固縮等凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。與轉(zhuǎn)染pVSVM+MBD2質(zhì)粒和pVSVM相比，轉(zhuǎn)染pVSVM-pMBD2雙質(zhì)粒對肺癌細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，VSVM和MBD2的聯(lián)合作用誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，對腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用，且雙表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比單獨(dú)轉(zhuǎn)染組的效果更顯著?？赡艿脑蚴牵烙嘏c水泡口炎病毒基質(zhì)蛋白可同時(shí)在細(xì)胞中表達(dá)，增強(qiáng)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡的作用，研究表明防御素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[14]，兩者聯(lián)合增強(qiáng)了其作用效果。也可能是溶瘤病毒激活免疫信號(hào)，促進(jìn)免疫組分與腫瘤細(xì)胞之間相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[15]，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。另外，DC趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VSVM與MBD2共表達(dá)質(zhì)粒仍保留了MBD2趨化活性，即pMBD2具有良好的DC趨化作用。已有研究表明，β-防御素具有強(qiáng)大的趨化活性[16]。即MBD2可以招募未成熟的DC細(xì)胞和記憶T細(xì)胞CCR6，機(jī)制是與TLR4相互作用。也就是說，MBD2可以將未成熟的DC細(xì)胞招募至腫瘤所在位置，從而發(fā)揮其抗原呈遞功能，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。對VSVM而言，因?yàn)镺V可以促進(jìn)部分細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，且效果與抗原激動(dòng)性腫瘤疫苗相似，使其成為了免疫檢查點(diǎn)阻斷的聯(lián)合治療的理想伴侶[17]，所以在我們的研究中選擇MBD2和VSVM的聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞的影響，可能是MBD2誘導(dǎo)了幼稚DC和T細(xì)胞成熟，提高機(jī)體獲得性免疫能力，同時(shí)VSVM也可激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，兩者聯(lián)合加強(qiáng)了抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

綜上所述，MBD2和VSVM聯(lián)合作用，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，可以抑制肺癌細(xì)胞LL/2的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并保留了防御素的趨化功能，有望成為肺癌治療的新策略。本研究探討MBD2和VSVM共表達(dá)質(zhì)粒對肺癌細(xì)胞的作用效果，但具體機(jī)制尚未明確，還需以此細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)一步深入研究。