徐園園 任亞麗 盧學(xué)超 解其華 王春華 魏迎鳳，#

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是造成慢性腎功能衰竭的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞功能紊亂參與糖尿病腎病的發(fā)病過程。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是重要的致纖維化因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長和腎小球系膜細(xì)胞增生以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成[1]，是誘導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子。補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(CTRP)家族是脂聯(lián)素家族的一個分支，可調(diào)節(jié)胰島素敏感性、炎癥和脂質(zhì)代謝。CTRP3(也稱為Cartducin/COR26)是CTRP家族的重要成員，有研究發(fā)現(xiàn) CTRP3與糖脂代謝有關(guān)，能增加胰島素敏感性[2]。本研究旨在分析TGF-β1、CTRP3在糖尿病腎病大鼠腎組織中表達(dá)的變化并初步探討CTRP3在其中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠16只，清潔級，體重260±20g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2014-0001，使用許可證：SYXK(蘇)2012-0031。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司(批號：S0130)，兔抗大鼠TGF-β1 多克隆抗體購自美國Abcam公司(批號：GR262076-9)、兔抗大鼠CTRP3多克隆抗體購自美國Abcam公司(批號：ab36870)，即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：AR0010)，葡萄糖測定、尿素測定試劑購自上?？迫A生物工程股份有限公司(批號：20200122、202010212)，尿蛋白、甘油三酯、總膽固醇檢測試劑盒購自美康生物科技股份有限公司(批號：191213102、200613101、200510201)，肌酐檢測試劑盒購自日立化成診斷系統(tǒng)株式會社(批號：504AJA)，C反應(yīng)蛋白檢測試劑盒購自貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司(批號：447280)。

儀器：LEICA組織包埋機(jī)(EG1150型)，LEICA石蠟切片機(jī)(RM2145型)，病理組織漂烘儀(PHY型)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX51)，日本日立全自動生化儀(LABOSPECT 008AS)，美國貝克曼庫爾特特定蛋白分析儀(IMMAGE 800)。

1.3 方法

1.3.1動物分組和模型的建立：實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠飼養(yǎng)在清潔級屏障動物房內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，濕度控制在55%±5%，自由采食和飲水，室內(nèi)照明采用12h∶12h明暗交替。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字法將16只大鼠分為糖尿病腎病組(DN組)及正常對照組(NC組)，每組各8只。DN組禁食12h后腹腔一次性注射STZ(60mg/kg)，NC組注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液。72h后采鼠尾血，采用葡萄糖氧化酶法(強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀)測定血糖，如血糖濃度≥16.7mmol/L，則糖尿病模型造模成功。造模成功大鼠再飼養(yǎng)兩周后收集尿液，每日平均尿量較造模前至少增加50%，且24h尿蛋白排泄率>30mg的大鼠定為糖尿病腎病模型大鼠。本文DN組大鼠全部造模成功。

1.3.2標(biāo)本收集：糖尿病腎病大鼠造模成功后，兩組大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)8周，于8周末處死前一天收集24h尿液，第8周末每只大鼠稱重后腹主動脈采血，解剖腎臟去除包膜，留取腎臟組織。

1.3.3尿液及血液樣本檢測：采用全自動生化分析儀，鄰苯三酚紅鉬絡(luò)法測定24h尿蛋白。采用全自動生化分析儀測定血糖、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇，采用特定蛋白分析儀測定C反應(yīng)蛋白。根據(jù)血肌酐及體重計算腎小球?yàn)V過率。

1.3.4腎臟組織病理學(xué)觀察：將腎組織置入4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.3.5腎組織TGF-β1與CTRP3免疫組化染色：腎臟石蠟切片(厚3μm)，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，PBS反復(fù)沖洗，加入配置好的一抗(稀釋濃度1∶500)，4℃搖床過夜，PBS反復(fù)沖洗，加入二抗(稀釋濃度1∶1 000)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體及兔抗大鼠CTRP3多克隆抗體試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色顆粒狀表達(dá)為TGF-β1和CTRP3陽性細(xì)胞。于400倍光鏡下觀察陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，每張切片隨機(jī)選取10個區(qū)域，采用Mias-2000圖像分析系統(tǒng)測定陽性物質(zhì)的積分光密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠生化指標(biāo)及24h尿蛋白定量比較

DN組大鼠血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇、C反應(yīng)蛋白較NC組升高，腎小球?yàn)V過率較NC組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠生化指標(biāo)及24h尿蛋白定量比較

2.2 兩組大鼠腎臟病理改變

NC組大鼠腎小球未見損傷，系膜細(xì)胞、基質(zhì)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；DN組大鼠腎小球體積增大，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增多，腎小球內(nèi)可見散在炎性細(xì)胞浸潤(箭頭所示)。

2.3 各組腎組織TGF-β1、CTRP3蛋白表達(dá)比較

免疫組化染色提示NC組大鼠腎組織中有極少量的TGF-β1表達(dá)，CTRP3在腎小球、腎小管中均有表達(dá)；DC組TGF-β1在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)內(nèi)有表達(dá)(箭頭所示)，CTRP3表達(dá)減少。見圖2、圖3。半定量分析結(jié)果顯示，與NC組比較，DN組TGF-β1表達(dá)增加(P<0.01)，CTRP3的表達(dá)降低(P<0.01)。見表2。

表2 兩組大鼠腎組織中TGF-β1和CTRP3蛋白表達(dá)水平比較

2.4 大鼠腎臟組織CTRP3蛋白水平與其它指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示：CTRP3蛋白水平與TGF-β1蛋白(r=-0.630)、血糖(r=-0.558)、24h尿蛋白(r=-0.665)、血肌酐(r=-0.638)、C反應(yīng)蛋白(r=-0.531)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)(r=0.577，P<0.05)，與尿素氮、甘油三酯及總膽固醇無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病腎病是一種由遺傳和環(huán)境因素介導(dǎo)的復(fù)雜疾病，是終末期腎功能衰竭的主要病因，許多細(xì)胞和分子機(jī)制與糖尿病腎損害有關(guān)。糖尿病早期即引起基底膜增厚，足細(xì)胞凋亡和功能異常，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球屏障功能喪失。同時糖尿病也會引起腎小球系膜功能障礙、毛細(xì)血管阻塞和結(jié)節(jié)性病變，導(dǎo)致腎小球硬化[3]。本研究結(jié)果提示DN組大鼠血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇、C反應(yīng)蛋白較NC組顯著升高，腎小球?yàn)V過率較NC組顯著降低，說明DN組大鼠存在糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)及濾過功能的損傷。DN組大鼠病理提示腎小球體積增大，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增多，腎小球內(nèi)可見散在炎性細(xì)胞浸潤，病理結(jié)果與血液和尿液提示結(jié)果一致。

CTRP家族是脂聯(lián)素家族的一個分支，這個家族參與了各種疾病，包括動脈粥樣硬化、肝病、胰島素抵抗以及腎臟疾病等[4-6]。CTRP3是這一家族的重要成員，CTRP3的功能研究涉及到心血管系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)等多系統(tǒng)多方面[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CTRP3可能在糖尿病及其并發(fā)癥的病理生理過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示DN組大鼠腎組織CTRP3蛋白表達(dá)水平降低，且大鼠腎組織中CTRP3蛋白表達(dá)水平與血糖呈負(fù)相關(guān)，提示CTRP3可能參與了糖尿病的血糖調(diào)節(jié)。一項(xiàng)關(guān)于小鼠的研究[8]結(jié)果提示，CTRP3基因水平降低與胰島素信號傳導(dǎo)受損和胰島素敏感性降低相關(guān)。CTRP3基因水平的降低與胰島素抵抗、腫瘤壞死因子-α和糖化血紅蛋白相關(guān)，且隨著CTRP3基因水平的降低，糖尿病患病風(fēng)險增加[9]。故CTRP3可能是通過調(diào)節(jié)胰島素信號傳導(dǎo)和胰島素敏感性途徑來影響血糖水平。本研究結(jié)果亦提示大鼠腎組織CTRP3蛋白表達(dá)水平與C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示CTRP3可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。Ma等[10]研究結(jié)果提示，CTRP3通過改善炎癥反應(yīng)和激活腺苷單磷酸激活蛋白激酶(Adenine Monophosphate Activated Protein Kinase，AMPK)通路，改善胰島素信號傳導(dǎo)，發(fā)揮防治糖尿病心肌病的作用。但CTRP3改善炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確。本研究中大鼠腎組織中CTRP3蛋白表達(dá)水平與24h尿蛋白、血肌酐呈負(fù)相關(guān)，與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)，提示CTRP3可能參與腎小球?yàn)V過功能的調(diào)節(jié)。Hu等[11]研究發(fā)現(xiàn)CTRP3的過度表達(dá)抑制了腎小球系膜細(xì)胞的增殖，減少了活性氧的產(chǎn)生，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的擴(kuò)張，通過失活JAK2/STAT3信號途徑預(yù)防糖尿病腎病。以上研究結(jié)果均提示CTRP3是糖尿病腎病的保護(hù)因素。

本文結(jié)果還顯示DN組大鼠腎組織中TGF-β1 表達(dá)增加，支持TGF-β1參與了糖尿病腎病的纖維化過程。TGF-β包括一大類細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的生長、分化和形態(tài)發(fā)生。TGF-β在腎小球硬化、系膜增生性腎小球腎炎等腎臟疾病中起著重要作用[12]。它刺激系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生，誘導(dǎo)腎組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[13]。糖尿病患者的高血糖狀態(tài)可誘導(dǎo)TGF-β1基因表達(dá)和腎小球系膜外基質(zhì)的合成，導(dǎo)致腎小球硬化[14]。TGF-β1的增加可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制腎小球內(nèi)皮功能，使腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞之間的相互作用消失，足細(xì)胞損傷，出現(xiàn)蛋白尿[15]。因此，TGF-β1是糖尿病腎病發(fā)病的重要分子。DN組大鼠腎組織中CTRP3蛋白表達(dá)減少，相關(guān)分析提示大鼠腎組織CTRP3蛋白表達(dá)與血糖、24h尿蛋白、血肌酐、C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)，與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)。提示CTRP3與糖尿病腎病有關(guān)，可能參與了糖尿病腎病的代謝紊亂及炎癥反應(yīng)，是糖尿病腎病的保護(hù)因素，但具體機(jī)制尚不明確。相關(guān)分析亦提示CTRP3與TGF-β1存在負(fù)相關(guān)，究其原因可能因?yàn)門GF-β1可刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖，而CTRP3的過度表達(dá)抑制了腎小球系膜細(xì)胞的增殖。但CTRP3改善腎小球系膜細(xì)胞的增殖作用是否是通過抑制TGF-β1通路來實(shí)現(xiàn)的還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，腎小球系膜細(xì)胞功能紊亂是糖尿病腎病的重要病理改變。許多細(xì)胞因子參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。TGF-β1是重要的致纖維化因子，CTRP3可能成為糖尿病腎病治療方案中一個新的靶點(diǎn)。但本試驗(yàn)為動物試驗(yàn)，樣本量小，觀察時間短，僅有免疫組化結(jié)果，存在一定的不足，故相關(guān)結(jié)論仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。