張大武 劉劍剛 晁田田 熊 雙 董國菊

心血管疾病是國人死亡首要病因，隨著急診介入的快速發(fā)展和冠心病二級預(yù)防藥物的普及，急性心肌梗死(AMI)的死亡率得到了極大地控制[1]。但是，仍有部分患者，尤其農(nóng)村AMI患者早期經(jīng)皮冠狀動脈介入時機滯后，導(dǎo)致梗死后不可逆的心肌損害和心功能受損，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。如何挽救梗死后損傷心肌一直是心血管病研究的焦點。

尼可地爾是一種ATP敏感鉀離子(KATP)通道開放劑，也能作為一氧化氮供體擴張血管。其化學(xué)結(jié)構(gòu)由煙酰胺衍生物與硝基構(gòu)成，既作用于動脈血管床，又作用于靜脈血管床[2]，能顯著改善冠狀動脈痙攣，且療效優(yōu)于硝酸酯類藥物[3]，還能降低冠心病患者全因死亡和心臟性猝死[4]。本文應(yīng)用尼可地爾干預(yù)AMI模型大鼠，觀察其心肌損傷標(biāo)記物、心肌梗死面積、心臟形態(tài)和功能，以及冠脈微循環(huán)影響因子內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)和血栓烷B2(TXB2)等指標(biāo)變化，為臨床研究尼可地爾干預(yù)AMI提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量200g-230g，雄性，動物質(zhì)量合格證號：11400700262477，許可證號:SCXK(京)2016-0006，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食與飲水。

1.2 主要藥物和試劑

尼可地爾片(5mg/片)，由西安漢豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H61022860)，根據(jù)體表面積法，大鼠給藥劑量g/(kg·d)=成人每日劑量(g)×大鼠體重與體表面積比值/人體重與體表面積比值。按照尼可地爾片臨床給藥劑量換算后給予大鼠2.7mg/kg體質(zhì)量灌胃。

心肌肌鈣蛋白T(cTnT)檢測ELISA試劑盒(批號：20191208)、ET檢測ELISA試劑盒(批號：20191210)、CGRP檢測ELISA試劑盒(批號：20191210)由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司提供；TXB2檢測ELISA試劑盒(批號：20191210)，6-Keto-PGF1αELISA試劑盒(批號：20191210)由北京華英生物技術(shù)研究所提供；2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉末(TTC，美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，批號：T0765)，由北京萊博生物實驗材料研究所提供，實驗時將其用磷酸鹽緩沖液配制成0.5%應(yīng)用液。

1.3 儀器

DR-200BS型全自動酶標(biāo)分析儀(中國無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)；7160型全自動生化儀(日本HITACHI公司)；CARDIPIA 800B型心電圖儀(中國秦皇島市康泰醫(yī)學(xué)系統(tǒng)有限公司)；GE Vivid E95型超聲多普勒檢測儀(美國GE有限公司)；EPIQ5 S12-4型心臟超聲高頻探頭(荷蘭PHILIPS醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.4 模型制作與分組處理

參照有關(guān)文獻[5]，40只大鼠以2%戊巴比妥鈉水溶液(0.2ml/100g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，置于解剖臺上仰臥位固定，連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖。剪毛備皮胸骨左側(cè)并消毒。沿胸骨左緣3-4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉層，快速擠出心臟，剪開心包膜，在左心耳下緣、肺動脈圓錐的左緣之間，體表左冠狀靜脈投影位置(左冠狀動脈前降支)上1/3處穿刺進針，其中30只結(jié)扎血管，觀察心電圖變化，以其出現(xiàn)R波振幅降低、ST段偏移、T波改變(弓背樣抬高或T波高聳)，且肉眼觀察心肌呈暗紅色，即判斷為心肌缺血和心肌梗死形成[6]；還原心臟，逐層縫合胸骨和肌肉層。之后存活24h為成模進入實驗大鼠，共20只。余10只大鼠只穿線不結(jié)扎，作為假手術(shù)組。各組大鼠均肌肉注射青霉素鈉20萬U/天，連續(xù)3天，預(yù)防感染。實驗后動物按照《北京市實驗動物管理條例》和動物倫理學(xué)規(guī)定處置。

成模大鼠隨機分為模型組和尼可地爾組，每組10只；假手術(shù)組10只。術(shù)后48h開始，尼可地爾組連續(xù)灌胃尼可地爾(2.7mg/kg體質(zhì)量，灌胃濃度0.27mg/ml)28天，1次/天，模型組和假手術(shù)組灌胃等體積純凈水。末次給藥40min后，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉水溶液(0.2ml/100g體質(zhì)量)麻醉后，平行檢測以下各類指標(biāo)和血液指標(biāo)，觀察心肌梗死面積。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1心臟超聲指標(biāo)：三組大鼠麻醉后，采用超聲多普勒儀在同一心動周期下測量心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)，包括左心室收縮末期內(nèi)徑(LVEDS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、室間隔舒張末期厚度(IVST)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWT)、心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。連續(xù)測量3個心動周期，取平均值作為每只大鼠測定值，超聲檢查分析由不知道大鼠分組情況的兩名?？漆t(yī)生完成。

1.5.2血清標(biāo)志物cTnT及微循環(huán)因子指標(biāo)：完成超聲檢查后，各組大鼠經(jīng)腹主動脈采血4ml，靜置后離心，吸取血清，采用ELISA分別檢測cTnT、ET、CGRP、TXB2和6-Keto-PGF1α水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.5.3心肌梗死面積比：三組大鼠取血后，參照文獻[7]，用注射器吸取TTC溶液2-4ml自下腔靜脈注入心臟，3min后摘取心臟，置入-20℃冰箱中速凍30min后，從心尖部至心底部依次垂直于長軸均勻橫切成5張同樣厚度的心肌組織切片，于10%中性甲醛溶液中固定30min。在統(tǒng)一光照條件下使用Canon IXUS 990 IS相機微距拍照，應(yīng)用圖像分析軟件Image Pro-Plus Version 6.0(美國Media Cybernetics公司)計算心肌梗死面積比，即心肌梗死面積與心臟面積之比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟形態(tài)和功能指標(biāo)比較

假手術(shù)組大鼠心臟超聲心動圖可見左室心肌厚度均勻，舒縮運動正常。模型組超聲心動圖則顯示梗死區(qū)域心室壁變薄，部分心室壁局部向外擴張，呈室壁瘤樣改變，并隨心室舒縮活動呈明顯反常運動。三組大鼠LVEDD、LVEDS、IVST、LVEF水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而LVPWT水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD和LVEDS顯著升高(t=4.48，4.80，均P<0.01)，IVST和LVEF顯著降低(t=4.65，5.47，均P<0.01)。與模型組比較，尼可地爾組LVEDD和LVEDS明顯降低(t=2.42，2.08，均P<0.05)，LVEF顯著升高(t=3.17，P<0.01)，而IVST水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見圖1，表1。

圖1 各組大鼠心臟形態(tài)和功能超聲

表1 各組大鼠心臟形態(tài)和功能指標(biāo)比較均=10)

2.2 各組大鼠cTnT和微循環(huán)因子水平比較

三組大鼠cTnT、ET、TXB2水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而CGRP、6-Keto-PGF1α水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清cTnT、ET和TXB2水平顯著升高(t=4.16，2.50，3.04，P<0.05或P<0.01)，與模型組比較，尼可地爾組大鼠血清cTnT、ET和TXB2水平明顯降低(t=2.71，2.10，2.29，均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠微循環(huán)因子水平比較均=10)

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比比較

三組大鼠心肌梗死面積比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值為287.39，P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積比明顯升高(0.00±0.00 vs 0.34±0.03，t=2.27，P<0.01)。與模型組比較，尼可地爾組心肌梗死面積比明顯降低(0.34±0.03 vs 0.27±0.03，t=4.80，P<0.01)。

圖2 三組大鼠心肌梗死面積比較(TTC染色，標(biāo)尺1格=1mm)

3 討 論

心肌梗死后心臟功能受損是多種因素如缺血再灌注損傷、微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌激素激活等多種因素作用的結(jié)果[8]。其中微循環(huán)障礙對增加AMI患者心血管事件的發(fā)生有重要影響[9]。近年來研究顯示尼可地爾能通過擴張微小動脈，改善冠狀動脈血流和心肌收縮功能，從而改善AMI患者預(yù)后[10]。本實驗通過制作AMI大鼠模型及采用尼可地爾灌胃干預(yù)措施，觀察心肌梗死后大鼠心功能、心肌損傷標(biāo)記物和冠脈微循環(huán)影響因子水平以及心肌梗死面積的變化，結(jié)果顯示，尼可地爾能明顯改善心功能、降低心肌損傷標(biāo)志物和微循環(huán)因子水平，縮小心肌梗死面積。

冠脈微循環(huán)是由心臟微動脈、毛細血管和微靜脈組成的心肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能有效調(diào)節(jié)心肌血流和代謝。其功能障礙受到血管內(nèi)皮功能紊亂、血小板活化、神經(jīng)激素水平失衡及炎癥反應(yīng)等的影響[11]。ET和CGRP作為血管內(nèi)皮細胞舒縮的兩個最重要氨基酸多態(tài)，分別是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強縮血管物質(zhì)和最強擴血管物質(zhì)，其水平升高可收縮或擴張冠脈微血管。在本實驗中，AMI模型大鼠ET水平顯著增加，給予尼可地爾后明顯降低，但CGRP含量未見明顯增加，這與Sekiguchi等的報道結(jié)果相符[12]。表明尼可地爾可能主要通過調(diào)節(jié)ET水平發(fā)揮改善微循環(huán)障礙的作用。

而TXB2和6-Keto-PGF1α是一對反映血小板活化的指標(biāo)，分別為血栓烷A2(TXA2)和前列環(huán)素2(PGI2)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，兩者水平變化可提示血小板聚集、血管痙攣收縮或血栓形成。本研究結(jié)果顯示，AMI大鼠血清TXB2含量顯著增加，給予尼可地爾后顯著降低，6-Keto-PGF1α水平則無明顯變化。表明尼可地爾可能主要是通過抑制TXA2生成，從而發(fā)揮抑制血小板活化和改善微循環(huán)的作用。

心臟超聲指標(biāo)常用于評判心臟形態(tài)和功能變化，不論對缺血性心臟病AMI抑或心力衰竭，也無論對AMI后心臟功能保護和預(yù)后的評價。有研究認(rèn)為，LVEDD和LVEF更具價值[13-15]。本實驗結(jié)果顯示，AMI模型大鼠心肌LVEDD顯著增大，LVEF顯著降低；給予尼可地爾灌胃干預(yù)，其LVEDD減小，LVEF顯著提高。表明尼可地爾可改善AMI大鼠心肌重塑和心功能。

綜上所述，尼可地爾灌胃干預(yù)對AMI模型大鼠心臟形態(tài)和功能、心肌損傷標(biāo)志物、冠脈微循環(huán)相關(guān)因子和心肌梗死具有明顯的改善作用，為尼可地爾臨床干預(yù)AMI應(yīng)用研究提供了部分實驗依據(jù)。