陳 曦 黃道梅 孟繁博 鄭秀艷 李國林

(貴州省農業(yè)科學院現代農業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006)

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)是包含了熟知的阪崎克羅諾桿菌的一個新屬，是一種極具污染風險的食源性致病菌，可使新生兒感染壞死性小腸結腸炎、菌血癥、腦膜炎等多種疾病，且死亡率極高[1-2]?？肆_諾桿菌屬分布較為廣泛，近些年在五香肉、脫水米粉、調味品、生蔬、即食食品、嬰兒食品中均發(fā)現克羅諾桿菌的存在，其中嬰兒配方乳粉(powdered infant formula，PIF)已經被證實是該致病菌的主要污染源及傳播媒介，嚴重威脅新生兒和嬰兒的健康[3-5]。因此，對市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況和特征進行分析十分必要。

對分離自市售PIF的克羅諾桿菌進行生化表型分型和基因分型有助于揭示上述來源的克羅諾桿菌的污染情況和種群特征[6]。張麗麗[7]采用生理生化和分子生物學鑒定的方法對市售PIF進行了克羅諾桿菌的分離與鑒定，發(fā)現其污染率達到4.55%。Pan等[8]對我國市場中的PIF和較大嬰兒的配方乳粉進行克羅諾桿菌污染情況調查，污染率為10.2%，分離得到的49株克羅諾桿菌被分為了11個序列型(sequence type，ST)。此外，有研究者對分離自我國東北和中原地區(qū)市售PIF中的克羅諾桿菌進行了分型分析，發(fā)現分離自上述來源的克羅諾桿菌主要為阪崎克羅諾桿菌，其中優(yōu)勢的序列型為ST1、ST4和ST64[9]。上述研究在一定程度上揭示了我國克羅諾桿菌的種群特征，但有關貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況及種群特征的研究尚鮮見報道。

抗生素的使用被認為是治療克羅諾桿菌感染最常見的方法。研究表明，鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素以及環(huán)丙沙星對阪崎克羅諾桿菌均有明顯的抗應激作用，上述抗生素被認為是治療克羅諾桿菌感染的首選[10-11]。但是，長期使用抗生素或使用不當很有可能提高克羅諾桿菌對抗生素的耐受能力，甚至出現多重耐藥性菌株[12-13]。Kim等[14]從食品中分離得到的克羅諾桿菌對頭孢洛林和氨芐西林具有耐藥性。Fei等[9]發(fā)現與以往研究相比，分離自中國市售PIF中的克羅諾桿菌對氯霉素和慶大霉素的耐藥性有所增加。此外，已有學者從食品樣品中分離出了對頭孢噻吩、苯唑西林、青霉素、萬古霉素具有抗性的克羅諾桿菌，說明目前克羅諾桿菌耐藥性有增加的趨勢[15-16]。因此，對食品尤其是嬰兒食品中克羅諾桿菌的耐藥性進行實時監(jiān)測非常有必要。

本研究以貴州省市售的350份PIF樣品為研究對象，采用國標法和16S rRNA基因測序法對其進行克羅諾桿菌的分離鑒定，并通過分離株的生化表型分型、基因分型和抗生素耐藥性分析揭示分離自貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的特征，旨在為貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PIF來源：350份PIF樣品于2018年1月至2019年1月采集于貴州省各地區(qū)超市，其中覆蓋了5種品牌的PIF，分別標記為A、B、C、D和E，每種品牌采集70份樣品。

主要試劑：克羅諾桿菌標準菌株C.sakazakiiATCC 29544T和EscherichiacoliATCC 25922中國檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心；營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar)、營養(yǎng)肉湯(nutritious broth)、緩沖蛋白胨水(buffer peptone water)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modified lauryl sulfate tryptone broth- vancomycin)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soybean agar)、克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基(chromogenic medium of cronobacter)，青島海博生物有限公司；API 20E生化鑒定試劑盒及輔助試劑，法國生物梅里埃公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix，美國Omega公司；藥敏試紙，上海金穗生物科技有限公司；8種抗生素，西寶生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

DNP-250型大容量恒溫培養(yǎng)箱，常州菲普實驗儀器廠；SJ-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州艾達康醫(yī)療科技有限公司；Sartorius Sigma 2-16KL高速冷凍離心機，德國賽多利斯Sartorius集團；伯樂T100梯度PCR儀，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；Tanon 3500 凝膠圖像分析系統，德國耶拿儀器股份公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 克羅諾桿菌的分離鑒定 以《GB 4789.40-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗》[17]的方法為金標準，對PIF樣品中的克羅諾桿菌進行分離鑒定；隨后再對分離的菌株進行基于16S rRNA的分子鑒定。

1.3.2 API 20E表型分型 參照Nazarowec-white等[18]的報道采用API 20E的方法對克羅諾桿菌進行生化分型，以C.sakazakiiATCC 29544T的表型特征定義為生物表型1，其余分離菌株與其反應模式比較，刪除相同的生化反應，保留具有差異的生化反應項目，把每種區(qū)別于生物表型1的生化特征定義為另外一種新的生物表型，從而確定克羅諾桿菌的表型分型結果。

1.3.3 多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析 參照Baldwin等[19]的報道，由北京賽百盛基因技術有限公司完成引物(atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA)的合成。以克羅諾桿菌DNA為模板，PCR反應體系(50 μL)：模板DNA 2.0 μL、2× buffer 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL。擴增條件參照Baldwin等[19]的報道。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證，并完成基因測序。將測序獲得的持家基因序列在克羅諾桿菌MLST數據庫(http://pubmlst.org/cronobacter/)中進行比對，獲得克羅諾桿菌的等位基因編碼，根據對應的等位基因編碼最終確定分離菌株的序列型。

1.3.4 分子分型及系統發(fā)育樹的構建 從GenBank中下載克羅諾菌屬及腸桿菌屬的相關菌種標準菌株的16S rRNA序列作為參考序列，同測序獲得的分離菌株的16S rRNA序列共同進行系統發(fā)育分析。之后，將菌株7個持家基因序列串聯得到長度為3 036 bp的基因序列進行系統發(fā)育分析。利用Mega 6.0軟件，選擇最大似然算法進行系統發(fā)育分析，同時查找并下載克羅諾桿菌屬7個種標準菌株所對應的串聯序列，將其作為參考菌株序列，構建最小似然系統發(fā)育樹[20]。

1.3.5 克羅諾桿菌的耐藥性分析 選取八類常見的8種抗生素，分別為慶大霉素、磺胺、頭孢噻肟、萬古霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素，以EscherichiacoliATCC 25922作為質控菌株，利用Kirby-Bauer紙片擴散試驗法分析克羅諾桿菌對上述抗生素的耐藥性[21]。將菌懸液稀釋為0.5(以麥克法蘭標準計)，按照藥敏紙片的說明書進行試驗，根據抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(CLSI-M100-S19)[22]對結果進行判讀。

2 結果與分析

2.1 克羅諾桿菌的污染情況

以國標的檢測結果為金標準，利用16S rRNA基因測序進行基因層面的鑒定，結果如表1所示。鑒定結果均表明22株可疑菌株除S4為陰溝腸桿菌，其余菌株均鑒定為克羅諾桿菌，貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的檢出率為6%。此外，16S rRNA基因測序結果顯示以99%為閾值，21株克羅諾桿菌中有18株為阪崎克羅諾桿菌，另外3株克羅諾桿菌與阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌的相似性均高達98%以上。進一步分析不同品牌PIF中克羅諾桿菌的污染情況，結果如圖1所示，5種不同品牌PIF中，C品牌的污染率最高，為8.57%，A品牌的污染率最低，為4.28%。

表1 API 20E及16S rRNA鑒定結果Table 1 API 20E and 16S rRNA appraisal results

2.2 克羅諾桿菌的表型分型

利用API 20E生化鑒定的菌株共計22株(包括C.sakazakiiATCC 29544T)，菌株S4鑒定結果為陰溝腸桿菌，故不參與表型分型分析。API 20E生化試驗結果顯示(表2)，分離菌株在利用21項生化反應進行鑒定時，僅對精氨酸、鳥氨酸、脲酶、肌醇、山梨醇5種反應底物以及VP試驗的結果呈現差異。按照Nazarowec-white的表型分型方法對克羅諾桿菌進行表型分型，結果表明，22株克羅諾桿菌分為6種生物表型，其中生物表型1所占權重最高(占45.4%)，是分離菌株的主要表型。

圖1 不同品牌PIF中克羅諾桿菌的污染率Fig.1 Contamination rates of Cronobacter spp. in different brands of PIF

表2 克羅諾桿菌表型分型結果Table 2 Results of phenotypic typing of Cronobacter spp.

2.3 克羅諾桿菌的分子分型

2.3.1 16S rRNA分型 利用MEGA 6.0軟件對菌株的16S rRNA基因序列進行系統發(fā)育分析，結果如圖2所示，所有菌株分成兩個類群，21株分離菌株與克羅諾桿菌標準菌株位于同一類群GroupⅠ，親緣關系較近，而與菌株S4所在的陰溝腸桿菌GroupⅡ的親緣關系較遠，這與16S rRNA測定鑒定的結果一致。其中21株分離菌株進一步分為3個類群，所在同一類群的菌株系統發(fā)育關系較近。

圖2 基于16S rRNA 序列的最小似然系統發(fā)育樹Fig.2 Minimum likelihood phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

2.3.2 MLST分析 利用MLST技術確定菌株的序列型，結果如表3所示，21株克羅諾桿菌分為11個序列型，分別為ST193(7株)、ST157(3株)、ST189(2株)、ST208(2株)、ST37(1株)、ST212(1株)、ST336(1株，丙二酸鹽克羅諾桿菌)、ST4(1株)、ST142(1株)、ST17(1株)和ST23(1株)，表明分離自貴州省市售PIF的克羅諾桿菌具有較高的遺傳多樣性。其中，ST193和ST157的克羅諾桿菌菌株數量分別占總菌株數的33.3%和14.3%，為該地區(qū)市售PIF中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型。

在此基礎上對上述菌株進行系統發(fā)育分析，結果如圖3所示，所有菌株分為兩大類群，除菌株S3外，20株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌標準菌株同位于Group Ⅰ，同時Group Ⅰ進一步劃分為3個簇，歸屬同一簇中的菌株遺傳信息相似，親緣關系較近。Group Ⅱ包括2個簇，其中菌株S3與C.malonaticusLMG 23826同位于GroupⅡ1，從而進一步將菌株S3歸屬于丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌物種。此外，根據系統發(fā)育結果可知，分離株的親緣關系與其來源(不同品牌)無明顯內在聯系。

2.4 克羅諾桿菌的耐藥性分析

由表4可知，21株克羅諾桿菌對四環(huán)素和萬古霉素耐藥性較高，分別為80.1%和90.5%；而對氨芐西林、慶大霉素和氯霉素最為敏感，敏感率均達到95.2%，其次為環(huán)丙沙星(76.2%)、頭孢噻肟(71.4%)和磺胺(66.7%)。

3 討論

克羅諾桿菌是PIF中的A類致病菌，嚴重危害著新生兒的健康，因此，對該致病菌的檢測一直是研究重點。O’Brien等[23]調查了歐洲的PIF和嬰兒飲品克羅諾桿菌的污染情況，發(fā)現PIF中該致病菌的污染率為0，主要的污染存在于以谷物為主的嬰兒飲品中。Santos等[24]從42個來自巴西的PIF樣品中分離出12株克羅諾桿菌，污染率高達29%。Fatimah等[25]則發(fā)現埃及境內PIF中克羅諾桿菌的污染率為5.2%。Fei等[9, 26]于2015年和2018年對我國市售PIF進行了克羅諾桿菌檢測，污染率分別為3.5%和2.8%。本研究中，貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的總污染率為6%，對嬰幼兒的健康存在潛在的危害，應給予一定的重視。此外，在5種品牌中，C品牌的污染率最高，為8.57%，A品牌的污染率最低，為4.28%。此外，ST193是A、C和D品牌中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型，在B品牌中未被發(fā)現，而ST189是B品牌中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型。

對PIF中克羅諾桿菌進行生化表型分型和遺傳多樣性分析有助于了解該種群，以便制定針對性的防控措施[24]。API 20E生化鑒定是基于20種生化反

表3 克羅諾桿菌MLST分析結果Table 3 Results of MLST analysis of Cronobacter spp.

應對克羅諾桿菌進行鑒定和生化分型，這種方法存在一定的假陽性[27]。16S rRNA基因測序可以從基因層面對克羅諾桿菌進行鑒定，并對菌株進行基因分型，但這種方法的辨識度不高，無法將遺傳相似性較高的C.sakazakii與C.malonaticus區(qū)分開[9]。MLST分析由于其較高的辨識度和可共享性，已被普遍應用于細菌的分子分型。利用上述3種方法對克羅諾桿菌進行分型可以起到互補作用，一種菌株可以同時具有3種型別，組合在一起可進一步區(qū)分菌種的多態(tài)性。因此，本研究選取上述3種方法對分離株進行生化表型和基因分型，可以得到更全面的數據，從而提高對貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的認識。

本研究中，21株克羅諾桿菌中，20株為阪崎克羅諾桿菌，1株為丙二酸鹽克羅諾桿菌，說明分離自貴州省市售PIF的克羅諾桿菌的優(yōu)勢種為阪崎克羅諾桿菌，這與Fei等[9]和Joseph等[20]的報道一致。此外，將21株克羅諾桿菌分為11個序列型，其中ST193和ST157是主要的序列型。不同的是，在歐洲和新西蘭等地，ST1、ST40、ST9和 ST3是分離自PIF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型[28]。Muller等[29]發(fā)現ST83是瑞士PIF及生產環(huán)境中克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型。Fei等[9]對分離自我國東北和中原地區(qū)市售PIF中的克羅諾桿菌進行了分析，發(fā)現ST1、ST4和ST64為優(yōu)勢序列型。上述研究說明，分離自不同地區(qū)的克羅諾桿菌的優(yōu)勢序列型不同，這可能與PIF產品產地或銷售地的環(huán)境有關，因此有必要對特定地區(qū)PIF中的克羅諾桿菌進行遺傳多樣性研究，從而提供有針對性的防控依據。

表4 21株克羅諾桿菌耐藥性分析Table 4 Antibiotic susceptibility of 21 Cronobacter strains

圖3 7個持家基因串聯序列(3 036 bp)的最小似然系統發(fā)育樹Fig.3 Maximum-likelihood tree of the spliced sequences of the 7 house keeping genes (3 036 bp)

研究表明，早期分離自食品的克羅諾桿菌很少受到外界抗生素的作用，其對大多數的抗生素都非常敏感，因此，抗生素被認為是最有效的治療人體克羅諾桿菌感染的方法[10]。但是隨著抗生素的長時間使用，或者不科學的濫用，受試菌株可能會發(fā)生突變或者基因水平轉移，導致耐藥性增加[27, 30]。已有研究表明，由于臨床長期的使用，分離自醫(yī)院臨床環(huán)境中的克羅諾桿菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿卡米星、頭孢他啶和亞胺培南呈現不同程度的抗生素耐藥性[31-32]。此外，由于克羅諾桿菌有較強的產生生物膜的能力，使得其能夠長時間粘附在PIF生產設備表面，并起到減少抗生素對菌體破壞的作用，因此，生物膜對克羅諾桿菌的保護作用為其產生耐藥性創(chuàng)造了條件[33]。Fei等[9]研究發(fā)現，分離自我國市售PIF中的克羅諾桿菌對四環(huán)素和頭孢噻肟的耐藥性均為0，而在本研究中，分離自貴州省市售PIF中的克羅諾桿菌對四環(huán)素和頭孢噻肟的耐藥性為81.0%和14.3%，說明本研究中的受試菌株對四環(huán)素和頭孢噻肟的耐受性有所提高。因此，很有必要對PIF中克羅諾桿菌耐藥性進行持續(xù)的監(jiān)控。

4 結論

本研究調查了貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況，發(fā)現該地區(qū)PIF克羅諾桿菌的總污染率為6%，對嬰幼兒的健康具有潛在的威脅。利用API 20E生化鑒定系統、16S rRAN基因測序和MLST分析揭示了分離株的生化分型和基因多樣性，共分離得到21株克羅諾桿菌，其中20株為阪崎克羅諾桿菌，1株為丙二酸鹽克羅諾桿菌，分為6個生化表型，3個類群和11個序列型，其中ST193和ST157為優(yōu)勢序列型?？股啬褪苄栽囼灡砻鳎蛛x自貴州省市售PIF中的克羅諾桿菌對四環(huán)素和頭胞噻肟的耐受性有所提高。本研究結果有助于揭示貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況和種群特征，并為該致病菌的針對性防控和治療提供了有力的科學依據。