丁 謙,陳 鵬,曹 明

(安徽大學 化學化工學院,安徽 合肥 230601)

共價有機聚合物(covalent organic polymers，簡稱COPs)是一類共價有機分子組成的交聯(lián)結合多孔網絡結構，其具有比表面積大、組成與結構可控、易于修飾等特點，廣泛應用于氣體儲存與分離、多相催化及光電轉換等領域[1].近年來，通過網絡結構中特有的納米孔洞可高效負載抗腫瘤藥物，在藥物輸送領域顯示出巨大的優(yōu)勢.例如，Bai等[2]制備了一種孔徑可控的共價有機聚合物，并負載不同種類的藥物，結果顯示該共價有機聚合物具有載藥量高、生物相容性好和可控的藥物釋放等特點.Wang等[3]通過氨基與丙烯酸酯間的點擊反應，設計合成了一種光敏感的共價有機聚合物，并負載了化療藥物阿霉素(DOX).體內研究結果顯示COPs顯著延長了DOX的血液循環(huán)時間，提高了DOX在腫瘤部位的富集.將化療與光動力治療結合，獲得了優(yōu)異的腫瘤抑制效率[3].Zhang等[4]制備了一種可降解且具有適宜尺寸的COPs，通過硅烷偶聯(lián)劑穩(wěn)定后可實現(xiàn)抗癌藥物DOX的高效負載，并將PEG修飾姜黃素實現(xiàn)對其載藥材料親水性的修飾及熒光示蹤.小鼠活體實驗結果顯示,在靜脈注射后該納米載體能有效在裸鼠腫瘤部位富集，顯著增強抑瘤效果[4].

理想的藥物載體是在血液循環(huán)過程中具有良好的穩(wěn)定性并且有效地在腫瘤部位富集，而到達腫瘤組織后能將負載藥物有效釋放并到達作用靶點[5].如何解決這一對矛盾的要求是獲得高效治療的關鍵因素之一.近年來，在載體內引入光刺激響應性的官能團是一種有效的策略，可以增強藥物在腫瘤細胞內釋放的同時，降低藥物在血液循環(huán)過程的泄露.目前，常見的刺激信號主要為內源性(酸度、氧化還原性和酶等)和外源性(光、聲、磁場等)信號[6].其中，以光作為刺激響應信號，具有在特定時間和位置精確可控等優(yōu)勢，尤其是近紅外光具有更深的組織穿透特點[7].因此，基于光刺激響應型納米載體的構建并用于腫瘤的治療，近年來得到了科研工作者的廣泛關注.例如，Gurusamy等[8]制備了一種單線態(tài)氧敏感的乙烯基二硫醚的兩親嵌段共聚物的膠束，并包埋化療藥物和光敏劑.在可見光刺激下，單線態(tài)氧的生成不僅破壞了聚合物膠束增強化療藥物的釋放，而且將光動力治療與化療相結合，顯著增強腫瘤的治療效果[8].Liu等[9]將化療藥物吉西他濱和光敏劑卟啉通過單線態(tài)氧敏感的硫縮酮鍵進行連接，實現(xiàn)了光刺激藥物釋放的化學療法與光動力療法的有機結合.Jin等[10]制備了一種具有光觸發(fā)裂解的活性氧響應納米藥物，尺寸由大到小的轉變有效增強藥物在腫瘤內部的滲透性，并在胞內高效釋放出化療藥物.

筆者通過光敏劑卟啉(TCPP)與乙烯基二硫化衍生物間的酯化反應，制備了一類光激發(fā)活性氧敏感型的共價有機聚合物(COPs)，在其表面引入聚乙二醇以改善其水溶性，并物理包埋化療藥物DOX(圖1).一方面，在光照條件下，基于光敏劑產生的活性氧破壞共價有機聚合物的結構，從而釋放出內部包埋的化療藥物DOX，實現(xiàn)藥物在光響應下的可控釋放；另一方面，基于光敏劑產生的活性氧和化療藥物的協(xié)同作用，有望提高腫瘤的治療效果.

圖1 COPs的合成、DOX負載及藥物釋放流程圖

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

聚乙二醇單甲醚2000(PEG2000)、2-巰基乙醇和順1-2-二氯乙烯購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N,N-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)、二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三乙胺購自Aladdin；鹽酸阿霉素，純度為98%,購自安耐吉化學試劑有限公司；熒光探針(DCFH-DA)購自碧云天生物試劑公司；5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉購自北京華威銳科化工有限公司.

1.2 測試與表征

核磁共振氫譜(1H-NMR)AVANCE Ⅲ-400Hz型，德國Bruker，采用四甲基硅烷為化學位移的內標, 溶劑為氘代氯仿或氘代二甲基亞砜; 動態(tài)光散射(DLS)Zetasizer Nano ZS90型，英國Malvern，測量溫度設為25 ℃，以二次水作為分散介質，平衡2 min, 測試前通過0.22 μm過濾器除塵處理，平行測量3次；傅里葉紅外光譜儀(FTIR) iS50，美國Nicolet公司；熒光分光光度計F-2500型，日本Hitachi公司；紫外可見光譜(UV-Vis)UV-3600型，上海元析儀器有限公司；掃描電子顯微鏡(SEM) S-4800型，日本Hitachi公司，對樣品表面噴金20 s后在加速電壓5 kV下進行觀測；透射電子顯微鏡(TEM) JEM-2100型，日本Hitachi公司，將樣品溶液滴加到銅網表面，待烘干后在200 kV電壓下觀察.

1.3 實驗步驟

1.3.1 2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇的合成

參照文獻[8]合成2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇：將2-巰基乙醇(1.5 g，19.195 mmol)和NaOH固體(0.77 g，19.195 mmol)溶解在7.5 mL乙醇中，放入0 ℃冰浴中攪拌30 min，在N2保護氛圍下，向上述溶液中緩慢滴加預先溶解的順-1,2-二氯乙烯(0.93 g，9.6 mmol)乙醇溶液，80 ℃冷凝回流反應18 h(圖2).然后，將溶液冷卻至室溫，先用飽和食鹽水(20 mL)稀釋，再用無水乙醚(3×10 mL)洗滌萃取.將合并的乙醚溶液用二次水(3×15 mL)洗滌，加入無水MgSO4干燥，通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮得到粗產物.通過柱色譜法純化粗產物，洗脫劑使用乙酸乙酯/石油醚(70∶30)的混合物，所收集的產物溶液經旋干、真空干燥后，得到最終產物(Z)- 2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇，產率約70%.

圖2 2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇的合成示意圖

1.3.2 共價有機聚合物(COPs)的合成

0.1 g 2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇與0.24 g TCPP溶解在10 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中(n-COOH∶n-OH=1.1∶1)，隨后向上述溶液中加入0.30 g DCC和0.089 g DMAP，40 ℃攪拌反應24 h.最后，向反應溶液中加入1.2 g的聚乙二醇單甲醚2000 (PEG-2000)，將所得溶液轉移到透析袋中，采用透析法除去未反應的單體和過量的PEG，透析液放入冷凍干燥機中凍干處理48 h，得到固體粉末COPs，并用棕色瓶收集且在4 ℃冰箱中避光冷藏保存.

1.4 單線態(tài)氧的檢測

以二氯熒光素-二乙酸酯(DCFH-DA)定量分析ROS的產生效率[11].將0.5 mL的1 mmol·L-1DCFH-DA的乙醇溶液添加到2 mL的0.01 N NaOH中并室溫下攪拌30 min，將DCFH-DA水解轉化成二氯熒光素(DCFH).將DCFH用10 mL pH 7.4的PBS稀釋，并保存在冰箱備用.配置COPs (1 mg·mL-1)與DCFH的混合溶液，在635 nm的光照條件下(0.2 W·cm-2)，設定不同的時間間隔，在488 nm光激發(fā)下，測量溶液中的熒光變化，并收集490～700 nm的發(fā)射光譜.

通過1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為捕獲劑，對COPs材料產生單線態(tài)氧進行研究[12-13].取50 μL的DPBF(1 mmol·mL-1)加入3 mL的COPs (100 μg·mL-1)溶液中，在635 nm激光照射下(0.2 W·cm-2)，每間隔20 s測定溶液的紫外可見吸收光譜.

1.5 共價有機聚合物負載DOX

稱取25 mg COPs和10 mg DOX·HCl溶解于2 mL DMSO溶液中，加入15 μL的三乙胺，避光攪拌1 h.將混合溶液緩慢滴加到10 mL二次水中，繼續(xù)避光攪拌24 h，混合溶液放入透析袋(截留分子量3 500)，在pH=7.4的PBS(濃度為0.01 mol·L-1)中透析24 h，每隔4 h換1次透析液.最后，透析后的溶液在轉速為5 000 r·min-1下離心分離10 min除去未包覆的DOX，得到載藥聚合物溶液[14].DOX的載藥率和載藥效率參照以下公式進行計算.

1.6 DOX的體外釋放

1.6.1 不同pH條件下的藥物釋放

取10 mL上述載藥COPs溶液置于透析袋中(截留分子量3 500)，分別浸入50 mL釋放介質(PBS，pH 5.0，pH 7.4)的燒杯中，然后放置在37 ℃的水浴搖床中.按照設定的時間間隔，取出燒杯內2 mL的PBS緩沖溶液用于測定DOX并向燒杯中補加2 mL新鮮PBS緩沖液.通過紫外-可見分光光度計測量DOX在480 nm處的吸光度，根據(jù)測算的DOX的標準曲線計算樣品的DOX濃度，從而反推出DOX藥物的累計釋放率.

1.6.2 光照與黑暗環(huán)境下的藥物釋放

取10 mL載藥COPs溶液置于透析袋中(截留分子量3 500)，再將透析袋置于2個50 mL的pH 7.4的緩沖溶液燒杯中，并放置在37 ℃的水浴搖床中.其中一個燒杯使用錫箔紙完全避光，另一個樣品放置在635 nm的光照條件下(0.2 W·cm-2)，按照設定的時間間隔，分別取出燒杯內2 mL的PBS緩沖溶液待測，并向燒杯中補加2 mL新鮮PBS緩沖液..通過紫外-可見分光光度計測量DOX在480 nm處的吸光度，依據(jù)DOX的標準曲線，再計算出DOX的釋放比例[15-16].

2 結果與討論

2.1 COPs的表征

對COPs的結構與形貌等進行分析，結果如圖3所示.

圖3 2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇 (a) 與COPs (b) 的1H-NMR 、FT-IR (c)、UV-Vis (d)、熒光發(fā)射光譜 (e)

由圖3(a)所知，合成產物與設想產物結構相同，證明筆者成功合成了2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇.隨后，基于TCPP與光敏劑卟啉與2,2′-(乙烯-1,2-二基雙(磺胺二基))二乙醇間的酯化反應，一步法制備了光激發(fā)活性氧敏感型的COPs，并在其表面引入聚乙二醇以改善其水溶性(圖1).通過核磁氫譜表征了COPs的結構，由圖3(b)所示，經酯化反應后，可以看到PEG的化學位移(δ=3.3～3.8)，在δ=7.8～9.8之間能觀察到TCPP的特征化學位移.可能是COPs與PEG反應后形成的核殼結構，只能探測到表面的PEG，而內核結構的活動性下降并抑制了TCPP的化學結構信息[17].紅外光譜結果表明，在1 720 cm-1處出現(xiàn)了羰基的伸縮振動峰(圖3(c))，進一步表明了酯鍵的形成.紫外-可見光譜圖顯示，COPs具有TCPP的典型吸收峰 (圖3(d))，且呈現(xiàn)出熒光淬滅(圖3(e)).

接下來，筆者采用動態(tài)光散射(dynamic light scattering，簡稱DLS)儀、SEM 和AFM 對COPs的尺寸分布與形貌分析，結果如圖4所示.

圖4 COPs的DLS (a)、SEM (b) 和AFM (c) 表征

圖4中，DLS結果顯示COPs的平均流體動力學尺寸約為89 nm；SEM和AFM的結果表明COPs的微觀形貌是球形顆粒，尺寸大小與DLS結果基本一致.

2.2 單線態(tài)氧的檢測

以DCFH-CA為探針，活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成具有綠色熒光的DCF，從而間接反映活性氧的產生效率；此外，筆者還采用了DPBF為探針，光照不同時間后，檢測DPBF在415 nm處吸收峰的變化情況.結果如圖5所示.

圖5 DCF在530 nm處的熒光強度與時間變化曲線(a); DPBF吸光度與時間變化曲線(b)

由圖5(a)可知，以緩沖溶液PBS為對照，在光照射情況下，卟啉的熒光強度會隨著照射時間的增長而明顯增大，且形成的COPs在TCPP當量濃度一致的情況下，COPs生成活性氧的效率更高.圖5(b)顯示了DPBF在415 nm處的吸收值隨著照射時間的延長而逐漸減低，且COPs的吸光度降低程度更大，反映了COPs的活性氧生成效率更高，與DCFH的測試結果一致.以上結果表明：在COPs內部，由于疏水的卟啉分子彼此之間分離，降低了卟啉分子因聚集引起的活性氧自淬滅，且納米多孔結構有利于提高ROS生成能力和擴散距離[18-19].

2.4 COPs的載藥及體外釋放研究

以DOX為模擬藥物，通過透析法對DOX進行負載，并研究不同投料比對載藥率和載藥效率的影響，結果列于表1.

表1 投藥比對載藥效率與載藥量的影響

投藥比例(m(DOX)∶m(COPs))1∶81∶51∶2載藥效率48.0642.65539.73載藥率5.347.10213.24

由表1可以看出，以COPs為藥物載體，對DOX具有高效的負載性能，隨著投藥比的增加，DOX的載藥量逐漸增加，載藥效率逐漸下降.當投藥比為1∶2時，載藥量和載藥效率分別為13.24%和39.73%.一方面由于COPs的多孔網絡結構利于DOX通過擴散作用進入其內部，另一方面COPs在制備過程中部分羧基未參與酯化反應，攜帶負電荷的COPs與DOX間通過靜電作用結合(載藥前后的表面電位由-33.6 mV轉至-4.88 mV)，從而達到對DOX的高效負載.后續(xù)實驗中，選擇投藥比為1∶2時在不同pH、不同光照環(huán)境下DOX的釋放性能，結果如圖6所示.

圖6 負載DOX的COPs 在不同pH和光照下的藥物釋放曲線

由圖6可以看出，與在pH 7.4環(huán)境下相比，弱酸環(huán)境下(pH 5.0)DOX的釋放速率明顯加快，48 h的累積藥物釋放比例接近50%，呈現(xiàn)出良好的pH 響應性.在酸性質子化的環(huán)境下，一方面DOX分子結構中的胺基質子化，提高了DOX的親水性，另一方面COPs內部的羧基與DOX間的靜電作用減弱，這些因素均會加速DOX在酸性環(huán)境下的釋放速率.

在光照條件下(635 nm，0.2 W·cm-2)，DOX與無光照條件下相比釋放速度明顯加快 (圖6)，48 h內的釋放總量是無光照條件下的2倍.DOX在光照條件下的快速釋放原因可能是光激發(fā)光敏劑TCPP產生活性氧，導致COPs內部的乙烯基二硫鍵的裂解，使得共聚物結構破壞.為了驗證這樣的設想，筆者通過透射電鏡考察了COPs在光照前后的形貌變化，結果如圖7所示.

圖7 COPs的形貌在光照前(a)和光照后(b)的TEM圖

由圖7可以看出，光照前COPs的結構完整，而在光照2 min后，發(fā)現(xiàn)COPs的結構破壞，說明在光照刺激下COPs會產生結構解離，進而加速負載藥物的釋放.

3 結束語

(1) 筆者采用一步酯化反應法合成了COPs，通過探針法檢測了COPs的活性氧產生效率，結果表明其內部的多孔結構降低了卟啉分子因聚集引起的活性氧自淬滅，提高了ROS的產生效率.

(2) 以DOX為模擬藥物，采用透析法研究了COPs的載藥及體外釋放.結果顯示COPs的多孔結構對DOX具有高效的負載效率，在投藥比為1∶2的條件下載藥量為13.24%.體外釋放結果表明在弱酸環(huán)境(pH 5.0)和光照條件下，能顯著增強COPs對DOX的釋放效率.