韓麗媛 李 琳 安 新 王曉平

華北理工大學基礎醫(yī)學院 河北唐山 063210；①開灤總醫(yī)院

健康女性陰道內有大量正常寄生菌，其通過自身分泌的粘附物質與陰道上皮細胞結合，定居于陰道黏膜表面。陰道內的微生態(tài)菌群、解剖結構、內分泌調節(jié)和區(qū)域免疫系統(tǒng)組成了女性陰道微生態(tài)體系。體內雌激素含量的變化、致病菌的侵入、長期服用抗生素等因素會破壞陰道微環(huán)境，引起菌群失衡，導致陰道感染的發(fā)生[1-2],并發(fā)如流產、人乳頭瘤病毒(HPV)感染、腫瘤等嚴重后果[3-5]。近年來,女性陰道炎的發(fā)生頻率日益增加，目前仍缺乏有效治療手段。在控制感染的基礎上，重建并恢復陰道微生態(tài)環(huán)境可為陰道感染的治療提供新的思路[6-7]。本研究通過調查健康女性陰道正常菌群分布，篩選陰道微生態(tài)制劑候選種子菌，從而為女性陰道炎治療提供實驗基礎。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年10月～2019年3月華北理工大學附屬醫(yī)院及唐山市婦幼保健院婦科體檢中心體檢者249例，年齡(30.16±10.28)歲，月經周期結束至少3天，體檢前一周內未使用陰道藥物，3天內無性生活。排除外陰瘙癢、陰道充血及陰道分泌物增多等陰道炎癥狀的患者。

1.2研究方法

1.2.1分泌物常規(guī)檢查 以無菌拭子常規(guī)采集陰道分泌物，置于含1mL生理鹽水的無菌試管內，沿管壁旋轉擠壓棉拭子，制備分泌物懸液。在清潔載玻片上涂片，蓋上蓋玻片后于高倍鏡下檢查。鏡下觀察上皮細胞、白細胞、陰道桿菌與雜菌的數(shù)量，劃分清潔度。排除細菌、陰道毛滴蟲及真菌感染的標本。陰道清潔度判斷標準見表1。

表1 陰道分泌物清潔度判斷標準

1.2.2細菌性陰道病聯(lián)合檢測 ①取出反應板平衡至室溫；②將棉拭子在pH試紙上輕輕按壓，使分泌物浸潤試紙，待變色后立即判讀；③使用微量吸管向反應板(珠海麗珠試劑股份有限公司)上每孔滴加一滴分泌物懸液；④向檢測孔中分別滴加檢測液，輕拍混勻。置35℃～37℃隔水恒溫箱中溫育15分鐘，觀察各反應孔的顏色變化。結果判讀標準：①唾液酸酶檢測：變藍色或綠色為陽性，不變色為陰性。②過氧化氫檢測：不變色為陽性，變藍色或綠色為陰性。③白細胞脂酶檢測：變藍色或綠色為陽性，不變色為陰性。④pH檢測：≤4.4為陰性，屬于正常分泌物標本；>4.4為陽性，屬于異常標本。

1.2.3細菌培養(yǎng)及生化鑒定 標本分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、中國藍培養(yǎng)基及淋球菌培養(yǎng)基(濟南百博生物技術股份有限公司)。厭氧標本置于厭氧袋內， 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。普通培養(yǎng)將培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時。觀察各培養(yǎng)基上細菌生長情況，記錄菌落大小、形狀、顏色及溶血等指標。挑選優(yōu)勢菌落純培養(yǎng)后使用細菌生化反應鑒定儀(法國生物梅里埃股份有限公司)進行鑒定，4℃保存菌種備用。

1.2.4實時熒光定量PCR鑒定 根據(jù)菌落觀察及生化反應初步鑒定結果，選擇相應引物，實時熒光定量PCR(濟南歐萊博醫(yī)療器械有限公司)鑒定。選用熒光基團為SYBR Green Ⅰ，所選用的引物見表2。實時熒光定量PCR步驟：①將1000μL菌懸液于1200r/min，離心10分鐘后棄去上清液；②向沉淀物中加入裂解液， 60℃水浴10分鐘取出；③1200r/min離心10分鐘，取上清液為模板進行PCR擴增。反應條件為：預變性95℃30秒，變性95℃5秒，退火和延伸60℃30秒，40個循環(huán)。

表2 引物序列

1.3統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理，計數(shù)資料采用行×列表χ2檢驗，檢驗水準取雙側α=0.05。

2 結果

2.1常規(guī)鏡檢結果 健康女性陰道分泌物標本在高倍鏡下觀察可見上皮細胞、桿菌較多，而白細胞偶見。陰道炎患者分泌物標本在高倍鏡下觀察可見上皮細胞、桿菌較少，而白細胞>15個/HP，見圖1。249例健康體檢女性陰道分泌物高倍鏡鏡檢中， 有4例白細胞>15/HP，10例在高倍鏡下發(fā)現(xiàn)孢子，故剔除。

圖1 分泌物鏡檢結果注：(a)為健康女性分泌物鏡檢結果；(b)為陰道炎女性分泌物鏡檢結果

2.2細菌性陰道病聯(lián)合測定試劑盒檢測結果 235例標本中有1例標本唾液酸苷酶呈陽性，10例標本分泌物pH值>4.7，見表3。因不符合健康女性陰道分泌物標準，故剔除，將其余224例陰道分泌物標本進行細菌培養(yǎng)。

表3 235名健康女性陰道病聯(lián)合測定試劑盒結果

2.3細菌培養(yǎng)及生化反應初步鑒定結果 224份健康體檢者的標本中,經細菌培養(yǎng)及生化反應鑒定，分離嗜酸乳桿菌123株，分離率54.9%(123/224)；發(fā)酵乳桿菌98株，分離率43.8%(98/224)；棒狀桿菌68株，分離率30.4%(68/224)；緩癥鏈球菌37株，分離率16.5%(37/224)；表皮葡萄球菌32株，分離率14.3%(32/224)；馬胃葡萄球菌28株，分離率12.5%(28/224)；糞腸球菌19株，分離率8.5%(19/224)。分離培養(yǎng)的主要細菌菌落見圖2。

圖2 分離培養(yǎng)主要細菌菌落注：(a)為嗜酸乳桿菌菌落；(b)為發(fā)酵乳桿菌菌落；(c)為棒狀桿菌菌落

2.4實時熒光定量PCR鑒定結果 根據(jù)細菌培養(yǎng)及生化反應初步鑒定結果，選擇引物利用實時熒光定量PCR進行基因鑒定，其中有1例發(fā)酵乳桿菌和9例棒狀桿菌與細菌生化反應不一致,結果見表4。熒光定量PCR檢測結果見圖3，根據(jù)熒光定量PCR結果以直方圖描述陰道正常菌群頻數(shù)分布，見圖4。根據(jù)陰道正常菌群頻數(shù)分布，確定發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌及棒狀桿菌作為陰道微生態(tài)制劑的候選種子菌。

表4 生化反應鑒定與實時熒光定量PCR鑒定各種細菌例數(shù)及比例

圖3 健康女性陰道主要菌群PCR鑒定曲線(A嗜酸乳桿菌B發(fā)酵乳桿菌C棒狀桿菌)

圖4 陰道正常菌群頻數(shù)分布

3 討論

正常健康的微生態(tài)環(huán)境對于人體器官及系統(tǒng)、局部維持正常的功能非常重要。在感染、藥物等因素的作用下，局部的正常菌群比例可能被破壞，引起菌群失調，由此帶來的感染性疾病很難通過抗生素治療進行糾正。因此在藥物治療過程中，如果能夠應用微生態(tài)制劑重建局部的微生態(tài)環(huán)境，可以為菌群失調所導致感染性疾病的治療帶來新的思路。

本研究共收集健康體檢女性陰道分泌物標本249例，經高倍鏡檢查以及細菌性陰道病聯(lián)合測定，剔除25例樣本，符合正常分泌物標準標本共224例。將224例標本細菌培養(yǎng)后生化反應初步鑒定,根據(jù)生化反應結果,選擇相應引物應用實時熒光定量PCR進行分子生物學鑒定。結果表明在224例正常陰道分泌物標本中，分離率較高的細菌分別為嗜酸乳桿菌(123例，分離率為54.9%)、發(fā)酵乳桿菌(98例，分離率為43.8%)、棒狀桿菌(59株，分離率26.3%)。

乳桿菌主要包括發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、加式乳桿菌、詹氏乳桿菌等[8-9]。陰道鱗狀上皮細胞內的糖原經乳桿菌的作用分解成乳酸，使陰道的局部形成弱酸性環(huán)境。這種弱酸性環(huán)境不利于陰道內致病菌的生長。此外，乳桿菌通過替代、競爭排斥機制阻止致病微生物粘附于陰道上皮細胞，抑制病原菌的生長；同時分泌過氧化氫、細菌素等抑制致病微生物生長，從而維持陰道微生態(tài)的平衡。

棒狀桿菌需氧或兼性厭氧， DNA中的G+C含量較多。寄生在人體的皮膚、黏膜等處。棒狀桿菌屬具有免疫激活及介導作用，短小棒狀桿菌作為棒狀桿菌的分支，具有多種生物活性及免疫激活能力，包括激活單核巨噬細胞、自然殺傷細胞，誘生干擾素、腫瘤壞死因子及白細胞介素等多種細胞因子的產生，具有調節(jié)免疫功能[10]。棒狀桿菌通過寄生在陰道黏膜處，形成了天然的免疫屏障，達到陰道自潔的效果。此外，在224例標本中還分離到包括緩癥鏈球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、糞腸球菌等其他細菌，但分離率較低。

本次研究結果表明，嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、棒狀桿菌為健康女性陰道內的優(yōu)勢桿菌，在健康女性陰道中分離率較高，可作為陰道微生態(tài)制劑的候選種子菌株。