朱文標(biāo)，盧善明，李海南，羅文娟，肖煥欽，謝壽城，劉晉發(fā)

(1.梅州市人民醫(yī)院病理科，廣東 梅州 514031； 2.廣東三九腦科醫(yī)院病理科，廣州 510510)

膠質(zhì)瘤是常見的發(fā)生于腦、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約有5%～8%，5年病死率高居世界第三[1]。目前WHO主要通過臨床及病理組織特征進(jìn)行膠質(zhì)瘤分級，作為評估患者病情與預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)，但這一分級并不能準(zhǔn)確地反映膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后情況。近年來，關(guān)于膠質(zhì)瘤分子病理研究取得了重大進(jìn)展，相繼發(fā)現(xiàn)了一系列與膠質(zhì)瘤臨床特征、病理類型和預(yù)后情況均密切相關(guān)的分子標(biāo)志物。異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)基因第132位突變存在于80%以上的低級別膠質(zhì)瘤中，存在IDH1突變的膠質(zhì)瘤患者提示了較好的預(yù)后[2-4]。1號染色體短臂和19號染色體長臂(1p/19q)缺失主要發(fā)生在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，少部分也發(fā)生在星型細(xì)胞瘤，是少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)志檢測[5]。α-地中海貧血/智力低下綜合征X染色體連鎖基因(ATRX)突變在大部分星形細(xì)胞膠質(zhì)和混合型少突星形膠質(zhì)瘤中存在表達(dá)缺失，與1p/19q缺失存在排斥[6]。有文獻(xiàn)[2-3，7]指出IDH基因突變狀態(tài)對膠質(zhì)瘤預(yù)后的評估作用優(yōu)于組織學(xué)分級，1p/19q聯(lián)合缺失在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)生率高達(dá)80%～90%，且常伴有IDH突變，而大多數(shù)IDH突變型的星形細(xì)胞瘤中可見ATRX突變，并且它與lp/19q共缺失排斥，此三種分子分型均為目前臨床膠質(zhì)瘤常檢項(xiàng)目。本文聯(lián)合上述3種分子分型對膠質(zhì)瘤進(jìn)行分類，探討其對于膠質(zhì)瘤預(yù)后評估的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧2013年8月至2018年10月梅州市人民醫(yī)院收治的經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的104例膠質(zhì)瘤患者臨床及病理資料，所有患者均在本院進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)，且術(shù)前臨床及病理資料完整，術(shù)后可以取得聯(lián)系。其中男55例，女49例；年齡22～81歲，平均(51.92±12.50)歲；病理分型為少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤14例，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤33例，膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤57例；組織學(xué)分級低級別為27例，高級別為77例；腫瘤部位為額葉的58例，顳葉為26例，其他部位為20例；腫瘤大小1.30～9.60 cm，平均(5.19±1.72)cm；卡氏功能狀態(tài)評分(KPS)為10～90分，平均(62.60±21.45)。

1.2 研究方法

收集所有患者術(shù)前臨床病理資料，包括年齡、性別、病理分型、組織學(xué)分級、腫瘤部位、腫瘤大小與KPS評分，通過電話及智慧電子病歷系統(tǒng)隨訪患者的術(shù)后生存情況。采用IDH1、1p/19q和ATRX將膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行分子分型，分析該分型與患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。參考癌癥基因組圖譜(TCGA)[8]，首先依據(jù)IDH1基因?qū)⒛z質(zhì)瘤分為2組，然后依據(jù)1p/19q缺失、ATRX突變細(xì)分為以下四型。A型：IDH1突變，1p/19q缺失；B型：IDH1突變，1p/19q完整；C型：IDH1野生，ATRX突變；D型：IDH1野生，ATRX野生。

1.3 檢測方法

采用免疫組織化學(xué)法對存檔病理組織蠟塊進(jìn)行IDH1突變、ATRX表達(dá)缺失檢測。免疫組織化學(xué)采用Envision兩步法，IDH1(R132H)鼠抗人單克隆抗體(貨號：H09)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，ATRX人抗兔多克隆抗體(貨號：HPA001906)購自美國Sigma-Aldrich公司。具體操作步驟：以PBS作為陰性對照，先對石蠟組織進(jìn)行二甲苯梯度脫臘，乙醇去二甲苯后自然晾干，使用EDTA修復(fù)液在高溫高壓下修復(fù)抗體，過氧化氫溶液室溫孵育后，采用山羊血清封閉半小時(shí)，棄去血清，加抗體在4 ℃下孵育過夜，次日在37 ℃復(fù)溫，加入二抗孵育2 h，采用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。IDH1結(jié)果判讀：在顯微鏡下觀察，每張病理切片選取3個(gè)高倍鏡視野，IDH1突變以細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色為主，明顯高于背景的計(jì)為IDH1突變陽性。ATRX蛋白表達(dá)情況判讀：低倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野總細(xì)胞著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)占比，當(dāng)細(xì)胞著色強(qiáng)度≤30%且>70%以上細(xì)胞呈中等、弱或無著色狀態(tài)，記為表達(dá)缺失。

采用熒光原位雜交法檢測1p/19q缺失。1p/19q檢測探針(貨號：F.01081-01)購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。具體操作步驟：先對組織進(jìn)行脫臘水化后加蛋白酶消化，檸檬酸緩沖液漂洗后，梯度乙醇溶液脫水晾干，56 ℃烤片2～5 min，再于梯度乙醇溶液脫水，自然干燥，同時(shí)配置探針置于75 ℃使其變性，將變性后的探針10 μL滴在玻片雜交位置，加蓋玻片封片，置于42 ℃雜交24 h，2×SSC 10 min，于室溫下在70%乙醇洗滌干燥，載玻片雜交區(qū)域滴加10 μL DAPI進(jìn)行復(fù)染，暗處理10～20 min，熒光顯微鏡下選用合適的濾片來觀察。結(jié)果判讀：選擇腫瘤細(xì)胞區(qū)域，使其在視野下占細(xì)胞數(shù)超過60%，計(jì)數(shù)100個(gè)完整腫瘤細(xì)胞核，觀察紅/綠信號個(gè)數(shù)比，正常細(xì)胞核為2/2，存在缺失核為單個(gè)紅信號且紅/綠<0.5，除此之外則為信號不平衡的細(xì)胞核。當(dāng)缺失核的腫瘤細(xì)胞超過一半，則記為1p/19q共缺失。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方分析。生存分析采用Kaplan-Meier分析，繪制各分子分型生存曲線，采用對數(shù)秩檢驗(yàn)Log-Rank評估不同分型間總生存率的差異，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸對膠質(zhì)瘤的臨床病理和分子分型特征進(jìn)行多因素生存分析，判斷其獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分子分型與臨床病理特征間的關(guān)系

聯(lián)合分子分型與膠質(zhì)瘤患者的年齡、組織學(xué)分級、KPS評分與病理分型均有關(guān)(P<0.05)，其中與病理學(xué)分型的相關(guān)性最大，而與性別、腫瘤部位和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。A型大多出現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中；B型患者年齡最小，組織學(xué)級別最低，主要位于星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤；D型年齡最大，組織學(xué)級別最高，KPS評分最低；C型和D型主要存在于膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤中。見表1。

表1 膠質(zhì)瘤患者IDH、1p/19q和ATRX聯(lián)合分子分型與臨床病理特征間的關(guān)系

2.2 分子分型與Kaplan-Meier總生存期的關(guān)系

104例患者中，有7例失訪，37例生存，60例死亡。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，4組分子分型的膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總生存期差異顯著(Log-Rank：χ2=31.631，P=<0.001)，其中B型患者的中位生存期最長，由于該組納入患者死亡率未超過50%，所以無中位生存期統(tǒng)計(jì)值；A型患者的中位生存期為(56.500±0.000)個(gè)月，C型患者為(43.500±18.425)個(gè)月，D型患者中位生存期最短，僅為(11.500±1.782)個(gè)月。見圖1。

2.3 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存情況與患者年齡、組織學(xué)分級、KPS評分、病理分型、IDH1、ATRX、聯(lián)合分子分型和治療方案均獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、腫瘤部位、大小和1p/19q缺失無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 膠質(zhì)瘤患者Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

傳統(tǒng)組織學(xué)分級是預(yù)測腫瘤生物學(xué)活動(dòng)的一種常用手段，近年來隨著分子生物科學(xué)研究的深入和分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，分子診斷逐步運(yùn)用于各種腫瘤診療中，而臨床對于膠質(zhì)瘤的認(rèn)知也在不斷改變中。膠質(zhì)瘤是一種高度異質(zhì)性腫瘤，組織特征相似的膠質(zhì)瘤內(nèi)部分子遺傳學(xué)存在很大的差異，從而導(dǎo)致了WHO病理組織分級相同的個(gè)體預(yù)后差異較大[2]。

IDH1突變、1p/19q缺失與ATRX表達(dá)缺失是目前臨床膠質(zhì)瘤的常檢項(xiàng)目，本研究通過聯(lián)合此3種分子狀態(tài)將膠質(zhì)瘤患者分為四型，結(jié)果顯示不同分型間患者年齡、組織學(xué)分級、KPS評分均有顯著差異，其中與病理學(xué)分型的相關(guān)性最大，其次是組織學(xué)分級。A型大多出現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中；B型患者年齡最小，組織學(xué)級別最低，主要位于星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤；D型年齡最大，組織學(xué)級別最高，KPS評分最低；C型和D型主要存在于膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤中，這與既往研究[8-10]中單獨(dú)將這三類分子狀態(tài)與臨床病理組織學(xué)分級對照研究結(jié)果一致，提示A、B型惡性程度顯著低于D型，而C型介于之間。

生存分析結(jié)果顯示4種亞型間總生存期存在顯著的差異，其中D型，即IDH1與ATRX均為野生時(shí)，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后最差，中位生存期僅為(11.500±1.782)個(gè)月；而B型即IDH1突變且1p/19q完整的膠質(zhì)瘤患者生存情況較好，C型IDH1突變合并1p/19q缺失的患者生存情況較B型稍差，C型IDH1與ATRX均為突變。既往研究[7]指出存在1p/19q共缺失的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較好，這與本研究結(jié)果不一致，可能是由于既往研究未分析IDH1突變與1p/19q共缺失的預(yù)后情況。IDH編碼蛋白是三羧酸循環(huán)中的一種關(guān)鍵限速酶，可以催化異檸檬酸氧化成d-酮戊二酸，為細(xì)胞新陳代謝提供能量和生物合成的前體物質(zhì)，其催化反應(yīng)生成的產(chǎn)物還原型輔酶Ⅱ可作為體內(nèi)還原性氫的供體，參與細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激反應(yīng)、不飽和脂肪酸的氧化過程，當(dāng)IDH突變通過產(chǎn)2-羥戊二酸，抑制了α-酮戊二酸依賴性脯氨酸羥化酶，使得細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α水平升高，進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA甲基化，引起膠質(zhì)瘤的表觀遺傳改變[11]。IDH1突變對預(yù)后的影響可能與其減少了患者氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，而1p/19q共缺失的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長速度較慢，且對化療藥物敏感，所以單獨(dú)存在1p/19q共缺失的患者一般推薦化療[12-13]。ATRX與端粒的延長替代機(jī)制有關(guān)，同時(shí)也影響著與表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的其他細(xì)胞功能，在DNA復(fù)制和修復(fù)、染色質(zhì)高階結(jié)構(gòu)調(diào)控和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮了組蛋白伴侶的功能，其表達(dá)缺失可能促使癌細(xì)胞凋亡[14]。

COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，患者年齡、組織學(xué)分級、KPS評分、病理分型、IDH1、ATRX、聯(lián)合分子分型和治療方案均是膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存情況的獨(dú)立預(yù)測因素，其中聯(lián)合分子分型為本研究主要探討的預(yù)測因子，而其他因素均已在既往研究[1-3,5-7,9-14]中得到證實(shí)。本文為單中心研究，樣本量有限，而且由于一部分患者在中途失訪或死于其他原因，可能導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)一定偏倚，因此未來仍需進(jìn)一步加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期聯(lián)合這些分子亞型為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分類和診斷提供參考，為個(gè)體化治療指明方向。

綜上，聯(lián)合IDH1突變、1p/19q雜合缺失和ATRX突變對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行分子分型分為四型，D型惡性程度最高且預(yù)后較差，而B型惡性程度相對較低，預(yù)后情況較好。分子分型不僅與病理組織學(xué)分級密切相關(guān)，有助于臨床診斷，還可能為患者術(shù)后生存情況提供參考。