朱 平，廖 欣，梁欣泉，符麗梅，熊慕珺

(郴州市第一人民醫(yī)院血液科，湖南 郴州 423000)

白血病是一類嚴重危害人類生命健康的血液和骨髓惡性克隆性疾病。白血病干細胞的增殖失控和凋亡受阻是白血病發(fā)生、耐藥和復發(fā)的根源，除異體干細胞移植能治愈少數(shù)白血病患者外，目前并無根治白血病的有效方法。因此，如何有效地靶向清除白血病干細胞對治愈白血病具有重要意義。鼠雙微體2基因(MDM2)是抑癌基因p53的關鍵負調(diào)控因子，有報道[1-2]稱，MDM2在白血病患者中呈高表達，抑制MDM2表達可增加白血病細胞的化療敏感性。miRNA是一類較保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，有研究[3-5]報道，白血病中miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)生改變，引起其下游靶基因發(fā)生級聯(lián)反應，導致白血病的發(fā)生。廖芬芳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-431-5p在白血病患者體內(nèi)的相對表達水平下調(diào)，但miR-431-5p對白血病細胞增殖、凋亡的影響目前還不清楚，且miR-431-5p能否通過調(diào)控MDM2表達參與對白血病細胞增殖、凋亡的調(diào)控也尚未可知。因此，本研究探討miR-431-5p調(diào)控白血病細胞增殖、凋亡的分子機制，以期為白血病的臨床治療提供可行的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與細胞培養(yǎng)

選取郴州市第一人民醫(yī)院2017年1—12月收治并診斷為白血病患者20例，所有患者均同意使用其骨髓標本用于研究并簽署知情同意書。同時選取10例骨髓捐獻者正常骨髓細胞作為對照。白血病細胞HL-60和K562購于中國科學院上海細胞研究所。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)在37 ℃、濕度飽和、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)HL-60和K562細胞。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染與實驗分組

取對數(shù)期K562細胞，以每孔2×105個細胞數(shù)接種于96孔板，當細胞融合度約為50%時，利用LipofectamineTM2000將miR-431-5p和miR-NC分別轉(zhuǎn)染K562細胞。轉(zhuǎn)染方法如下：將miR-431-5p mimics或miR-NC溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫條件孵育5 min，同時取LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫條件孵育5 min，將兩者輕柔混合室溫靜置20 min，將含有miR-431-5p mimics或miR-NC的混合物加入到K562細胞中并分別標記為miR-431-5p組、miR-NC組。置于細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24～72 h進行后續(xù)實驗。為進一步驗證miR-431-5p是通過下調(diào)MDM2表達影響K562細胞的增殖和凋亡，在K562細胞同時轉(zhuǎn)入miR-431-5p模擬物和pcDNA3.1-MDM2，檢測過表達MDM2是否可逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對K562細胞增殖和凋亡的影響，轉(zhuǎn)染方法同上。實驗共分為以下幾組：miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-431-5p組(轉(zhuǎn)染miR-431-5p mimics)、miR-431-5p+pcDNA3.1組(miR-431-5p mimics和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染)和miR-431-5p+pcDNA3.1-MDM2組(miR-431-5p mimics和pcDNA3.1-MDM2共轉(zhuǎn)染)。

1.3 qRT-PCR檢測

利用TRIzol試劑分別提取白血病患者骨髓細胞、正常人骨髓細胞、白血病細胞HL-60及各組K562的總RNA，檢測其濃度和純度。將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-431-5p的相對表達量。引物序列如下：miR-431-5p-上游引物5′-TGTCTTGCAGGCCGTCATG-3′，下游引物5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATT-TG-3′。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活力

分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h各取一組K562細胞，加入MTT試劑20 μL·孔-1，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)上清，再加入DMSO試劑150 μL-1，孵育2 h至結晶完全溶解。用酶標儀檢測其在490 nm波長處各孔的OD值(用空白孔進行調(diào)零)，并繪制生長曲線。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

將轉(zhuǎn)染24 h的各組K562細胞轉(zhuǎn)移至EP管中，用預冷的PBS漂洗細胞2次，離心棄去上清液。加入500 μL的結合緩沖液重懸細胞，然后按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI進行染色，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞儀測定各組K562細胞的凋亡情況。

1.6 Western blot檢測

按照RIPA裂解液使用說明書裂解各組K562細胞，收集各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行檢測蛋白濃度。取30 μg已充分變性并冷卻至室溫的蛋白樣品上樣至PAGE膠的加樣孔，進行SDS-PAGE。電泳結束后，將已分離的細胞蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結束后，用5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，然后用Western blot洗滌液進行洗膜，共洗2次，每次3 min，吸盡封閉液后加入已稀釋的抗MDM2、GAPDH、CyclinD1、p21、Bax和Bcl-2蛋白的一抗(1：1000)，室溫孵育2 h后，將已漂洗后的PVDF膜中加入已稀釋的二抗(1：500)，室溫孵育1 h，用Western blot洗滌液漂洗后，進行ECL顯色、拍照，并對目的條帶灰度值進行分析(以GAPDH為內(nèi)參)。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

利用靶基因預測數(shù)據(jù)庫Target Scan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org)預測miR-431-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-431-5p的5′端可與MDM2 mRNA的3′-UTR區(qū)域特異性結合，猜測MDM2是miR-431-5p的靶基因。為驗證這一猜想，構建野生型WT-MDM2和突變型MUT-MDM2的MDM2的3′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-431-5p和miR-NC分別與WT-MDM2和MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染K562細胞，然后將各組K562細胞于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，并利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組K562細胞的熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 miR-431-5p在白血病患者和正常人骨髓細胞中的表達

圖1結果顯示，與正常人骨髓細胞(0.66±0.03)相比，白血病患者骨髓細胞(0.37±0.02)和白血病細胞HL-60(0.34±0.02)、K562中(0.23±0.01)miR-431-5p的表達均顯著下降(P<0.05)。

2.2 過表達miR-431-5p對白血病細胞K562增殖的影響

如圖2A所示，與miR-NC組相比，miR-431-5p組K562細胞中miR-431-5p的表達顯著升高(0.20±0.01比0.47±0.02，P<0.05)。表明，成功構建了過表達miR-431-5p的K562細胞株。圖2B—D結果顯示：與miR-NC組相比，miR-431-5p組K562細胞在24 h時的細胞增殖活力差異無統(tǒng)計學意義(0.38±0.03比0.36±0.03，P>0.05)，在48和72 h時細胞增殖活力顯著降低(0.88±0.05比0.44±0.04，1.56±0.05比0.61±0.05，均P<0.05)，增殖相關蛋白Cyclin D1的表達顯著降低(0.61±0.00比0.30±0.00，P<0.05)，P21的表達顯著升高(0.15±0.00比0.46±0.00，P<0.05)。表明，過表達miR-431-5p可抑制白血病細胞的增殖。

2.3 過表達miR-431-5p對白血病細胞K562凋亡的影響

如圖3所示，與miR-NC組比較，miR-431-5p組K562細胞的凋亡率顯著增加[(6.69±0.57)%比(20.60±1.58)%，P<0.05]，促凋亡蛋白Bax的表達顯著增加(0.43±0.00比0.81±0.00，P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低(1.03±0.00比0.49±0.00，P<0.05)。表明，過表達miR-431-5p可促進白血病細胞的凋亡。

2.4 miR-431-5p靶向、調(diào)控MDM2

圖4A顯示，miR-431-5p與WT-MDM2的3′UTR區(qū)域互補。圖4B顯示，野生型MDM2基因熒光素酶表達載體WT-MDM2和miR-431-5p mimics共轉(zhuǎn)染K562細胞后，miR-431-5p組K562細胞熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低(1.05±0.00比0.50±0.00，P<0.05)；而突變型MDM2基因熒光素酶表達載體MUT-MDM2和miR-431-5p mimics共轉(zhuǎn)染K562細胞后，miR-431-5p組K562細胞熒光素酶活性較miR-NC組差異無統(tǒng)計學意義(1.02±0.00)比1.04±0.00，P>0.05)。圖4C—D結果顯示，與miR-NC組比較，miR-431-5p組K562細胞中MDM2蛋白的表達量顯著減低(0.66±0.06比0.23±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-431-5p組K562細胞中MDM2蛋白的表達量顯著升高(0.64±0.05比0.98±0.07，P<0.05)。提示，MDM2是miR-431-5p的靶基因，miR-431-5p可負性調(diào)控MDM2的表達。

2.5 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對白血病細胞K562增殖的抑制作用

如圖5所示，與miR-NC組相比較，miR-431-5p組K562細胞在24 h時的細胞增殖活力變化差異無統(tǒng)計學意義(0.38±0.03)比0.36±0.03，P>0.05)，在48 h和72 h時細胞增殖活力顯著降低(0.88±0.05比0.44±0.04，1.56±0.05比0.61±0.05，均P<0.05)，Cyclin D1和MDM2的表達顯著降低(0.61±0.00比0.30±0.00，0.59±0.00比0.21±0.00，均P<0.05)，P21的表達顯著升高(0.15±0.00比0.47±0.00，P<0.05)；與miR-431-5p+pcDNA3.1組比較，miR-431-5p+pcDNA3.1-MDM2組K562細胞在24 h時的細胞增殖活力變化差異無統(tǒng)計學意義(0.47±0.04比0.36±0.03，P>0.05)，在48 h和72 h時細胞增殖活力顯著升高(0.38±0.03比0.66±0.05，0.68±0.05比1.13±0.06，均P<0.05)，Cyclin D1和MDM2的表達顯著升高(0.29±0.00比0.48±0.00，0.20±0.00比0.39±0.00，均P<0.05)，P21的表達顯著降低(0.47±0.00比0.32±0.00，P<0.05)。表明，過表達MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對白血病細胞K562增殖的抑制作用。

2.6 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對白血病細胞K562凋亡的促進作用

如圖6所示，與miR-NC組比較，miR-431-5p組K562細胞的凋亡率顯著增加[(0.71±0.57)%比(20.60±1.58)%，P<0.05]，Bax蛋白的表達顯著增加(0.43±0.00比0.81±0.00，P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達顯著降低(1.03±0.00比0.49±0.00，P<0.05)；與miR-431-5p+pcDNA3.1組比較，miR-431-5p+pcDNA3.1-MDM2組K562細胞的凋亡率顯著降低[(20.88±1.38)%比(13.38±0.82)%，P<0.05]，Bax蛋白的表達顯著降低(0.83±0.00比0.63±0.00，P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達顯著升高(0.49±0.00)比0.71±0.00，P<0.05)。表明，過表達MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對白血病細胞K562凋亡的促進作用。

3 討論

miRNA是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的長度約為22個核苷酸的非編碼RNA。近年來，由于miRNA在白血病發(fā)病機制、早期診斷和預后中的重要作用，已引起人們的廣泛關注。ZHAO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-570在慢性髓性白血病中呈低表達，過表達miR-570抑制細胞增殖，促進細胞凋亡；LOU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-187-5p在急性淋巴細胞白血病中呈高表達，且miR-187-5p通過靶向DKK2促進白血病細胞的生長，并抑制其凋亡。BRAGA等[9]指出miR-15a和miR-16-1對判斷慢性淋巴細胞白血病預后具有重要價值。miR-431-5p屬于miR-431簇的成員之一，在肺癌、結腸癌、肝癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR-431存在異常表達，且miR-431通過調(diào)控其下游靶基因參與對腫瘤細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[10-13]。但miR-431-5p對白血病細胞增殖和凋亡的調(diào)控機制尚不清楚。本研究首先對白血病患者、正常人骨髓細胞和白血病細胞HL-60、K562中miR-431-5p的表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-431-5p在白血病細胞中呈低表達，推測miR-431-5p與白血病細胞的異常增殖和凋亡有關。隨后以K562細胞為研究對象，構建過表達miR-431-5p的K562細胞株，發(fā)現(xiàn)Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達明顯下調(diào)，P21和Bax蛋白的表達明顯上調(diào)，細胞的增殖活力減弱，凋亡率升高。提示，miR-431-5p可能作為一種抑癌基因在白血病中發(fā)揮作用。

MDM2基因定位于12號染色體q13～14位置，其在人體的各個組織器官中均有表達，其編碼的蛋白產(chǎn)物p90通過與p53蛋白結合，促進p53蛋白的降解，從而導致抑癌基因p53失去抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的能力。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2的過表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關：MDM2在膀胱癌細胞中呈過表達，抑制MDM2表達可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14]；MDM2可通過激活Smad通路促進卵巢癌SKOV3細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[15]；MDM2與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關[16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，MDM2基因的過度表達在白血病發(fā)生及不良預后中起重要作用，但miR-431-5p能否通過調(diào)控MDM2表達參與對白血病細胞增殖、凋亡的調(diào)控尚未可知。本研究通過生物信息學網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，miR-431-5p可與MDM2基因mRNA的3′UTR區(qū)域特異性結合；Western blot檢測顯示，miR-431-5p可負性調(diào)控MDM2的表達。為了進一步驗證miR-431-5p通過靶向調(diào)控MDM2參與對白血病細胞增殖和凋亡的調(diào)控，進行功能回復實驗，把miR-431-5p模擬物和過表達MDM2載體pcDNA3.1-MDM2共轉(zhuǎn)染K562細胞，發(fā)現(xiàn)過表達MDM2可逆轉(zhuǎn)miR-431-5p對白血病細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。以上結果提示，miR-431-5p是通過調(diào)控MDM2表達而發(fā)揮作用的，因此推斷miR-431-5p通過靶向下調(diào)MDM2可抑制白血病細胞的增殖，促進白血病細胞的凋亡，遏制白血病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-431-5p在白血病細胞中呈低表達，上調(diào)miR-431-5p通過靶向下調(diào)MDM2可抑制白血病細胞的增殖，促進白血病細胞凋亡。因此，miR-431-5p有望成為白血病治療的潛在靶點。