尤苗苗，張祖磊，許偉長，蘆 潮，龔 藝，楊 威

(1.江西省胸科醫(yī)院胸外科，南昌 330006； 2.南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2017級； b.第二附屬醫(yī)院心臟大血管外科，南昌 330006；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科，江西 贛州 341000)

肺癌是男性中最常見的癌癥[1-2]，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌(LC)類型，占所有肺癌病例的85%[3]。NSCLC的治療選擇約占所有肺癌的80%，一直是醫(yī)學(xué)上的挑戰(zhàn)[4-5]。前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(PBEF)是具有促進(jìn)B前體細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子，也稱為煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)，它是合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的限速酶[6]。血漿中的PBEF用作急性肺損傷(ALI)的生物標(biāo)志物[7-8]，在ALI大鼠肺組織中PBEF表達(dá)也上調(diào)，而PBEF表達(dá)的降低則為ALI減輕[9-10]。PBEF可以激活包括NF-κB，細(xì)胞凋亡和Toll(Toll樣)受體通路，從而影響肺部炎癥反應(yīng)和肺泡液清除(AFC)的效率[11-12]，通過該通路可以維持肺泡上皮細(xì)胞與氣體接觸表面的液膜，以維持氣體交換[13]。鈉離子主要通過上皮細(xì)胞中鈉離子通道(ENaC)和Na，K-ATPase的配位，進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞并形成滲透壓，從而吸收肺泡液[14-15]。水通道蛋白(AQP)是水進(jìn)入細(xì)胞的途徑之一，也是氧氣運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ繹16-17]。

缺氧和復(fù)氧(H/R)是許多細(xì)胞的應(yīng)激過程，如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)[18]、心肌細(xì)胞[19]等，在此過程中多個(gè)信號通路被激活，它們彼此相互作用。并且H/R過程在腫瘤微環(huán)境中對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也有影響[20]。有研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，肺上皮細(xì)胞中鈉通道蛋白α(ENaCα)的表達(dá)受PBEF負(fù)調(diào)控。MING等[23]發(fā)現(xiàn)PBEF在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的過度表達(dá)可以抑制水通道蛋白1(AQP1)的表達(dá)并促進(jìn)IL-6、IL-8、TNF-a和其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而PBEF基因的沉默可以增加PBEF的表達(dá)；并且他們還發(fā)現(xiàn)PBEF通過(MAPK)途徑促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并調(diào)節(jié)炎癥因子和AQP1的表達(dá)。NSCLC主要是肺上皮細(xì)胞癌變，基于此，本研究通過觀察PBEF對H/R處理的NSCLC細(xì)胞生長以及AQP1和ENACα表達(dá)的影響，探討PBEF對NSCLC的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人NSCLC細(xì)胞A549(美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供)；Dulbecco改良的老鷹培養(yǎng)基、10%胚胎血清(美國Gibco公司)；重組pcDNA3.1質(zhì)粒、對照熒光素酶載體、脂質(zhì)體2000、TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol試劑(美國Thermo公司)；硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)；兔多克隆抗AQP、兔多克隆抗ENaCα、辣根過氧化物酶綴合的二抗(北京博奧森公司)；兔多克隆抗PBEF(上海艾博抗公司)；Annexin-V/碘化丙啶(PI)染色劑(美國BD公司)；PBEF的過表達(dá)質(zhì)粒(上?；蚬?。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人NSCLC細(xì)胞在Dulbecco改良的老鷹培養(yǎng)基、10%胚胎血清、5%CO2的飽和濕度、37 ℃條件下培養(yǎng)。每2～3 d更換培養(yǎng)基維持細(xì)胞并傳代培養(yǎng)直到細(xì)胞達(dá)到70%匯合。將傳代培養(yǎng)的NSCLC A549細(xì)胞分為4組：對照組(C組)、H/R處理模型組(M組)、H/R處理+pCAGGS空載組(pCAGGS NC組)、H/R處理+pCAGGS PBEF組(pCAGGS PBEF組)。

A549細(xì)胞H/R處理：5%CO2、95%N2條件下厭氧培養(yǎng)18 h，然后在正常培養(yǎng)條件下復(fù)氧培養(yǎng)24 h。將A549細(xì)胞接種在6孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

使用脂質(zhì)體2000將攜帶PBEF開放閱讀框(2 μg·mL-1)的重組pcDNA3.1質(zhì)粒和對照熒光素酶載體(4 μg)轉(zhuǎn)染到H/R處理的A549細(xì)胞中。具體方法如下：取2個(gè)EP試管，分別向其中加入125 μL Opti-MEM，然后在一個(gè)試管中加入5 μL脂質(zhì)體2000，在另一個(gè)試管中加入1 μL質(zhì)粒和5 μL P3000，輕輕混合，然后靜置在室溫下放置5 min。將2個(gè)管混合并在室溫下放置20 min。將混合液滴入六孔板的相應(yīng)孔中，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后，將細(xì)胞加入含20%血清的1 mL完全培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。孵育48 h后，使用定量RT-PCR或Western blot分析確定轉(zhuǎn)染成功情況。

1.2.2 Western blot(WB)檢測

在4 ℃條件下，用裂解緩沖液裂解30 min后得到肺癌細(xì)胞，以10 000 r·min-1的速度離心10 min后收集上清液。使用BCA方法檢測蛋白質(zhì)濃度。在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)(每泳道50 μg)，然后電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，將膜用5%非脂乳封閉2 h，然后在0.1%Tween 20的TBS中洗滌3次，每次10 min，然后與兔多克隆抗PBEF，兔多克隆抗AQP和兔多克隆抗ENaCα在4 ℃過夜。然后將膜在TBS+0.1%Tween 20中洗滌3次，并與辣根過氧化物酶綴合的二抗一起在室溫下孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法檢測免疫復(fù)合物，并通過數(shù)量1(4.4-4.6)進(jìn)行分析。

1.2.3 RT-qPCR檢測

使用Trizol試劑從每組細(xì)胞中提取總RNA。使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并將cDNA用作RT-qPCR的模板。β-肌動(dòng)蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照。反應(yīng)在96孔光學(xué)板中于95 ℃進(jìn)行10 min，然后在95 ℃進(jìn)行40循環(huán)15 s，在57.3 ℃進(jìn)行1 min。定量循環(huán)(Cq)數(shù)據(jù)是使用默認(rèn)閾值設(shè)置確定的，Cc定義為熒光通過固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。一式兩份進(jìn)行反應(yīng)以使每個(gè)RNA分離物一式三份。用RT-qPCR計(jì)算各組PBEF的相對表達(dá)，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)標(biāo)。使用的引物序列如下：PBEF-F為CCGACTCCTACAAGGTTACTCA，PBEF-R為TTGGCTTCCTGGAT-TTTCTC；β-肌動(dòng)蛋白-F為TATCCCTGTACGCCTCTGG，β-肌動(dòng)蛋白-R為AATGTCACGCACG-ATTTCC。

1.2.4 流式細(xì)胞儀定量凋亡

使用膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶(PI)染色確定細(xì)胞活力，方法如下：膜聯(lián)蛋白-V/PI表示存活，膜聯(lián)蛋白-V+/PI表示早期凋亡，膜聯(lián)蛋白-V+/PI+表示晚期凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PBEF在A549細(xì)胞中成功過表達(dá)

pCAGGS PBEF組PBEF mRNA與蛋白表達(dá)水平較C組、pCAGGS NC組均顯著增加(P<0.05)，見圖1。

2.2 PBEF的過表達(dá)促進(jìn)經(jīng)H/R處理的A549細(xì)胞凋亡

M組A549細(xì)胞凋亡率顯著高于C組(P<0.05)，pCAGGS PBEF組A549細(xì)胞凋亡率顯著高于pCAGGS NC組(P<0.05)，M組和pCAGGS NC組A549細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這表明PBEF的過表達(dá)顯著加重了H/R誘導(dǎo)的晚期A549細(xì)胞凋亡率。見圖2。

2.3 PBEF的過表達(dá)抑制經(jīng)H/R處理的A549細(xì)胞中的AQP1和ENaCα表達(dá)

pCAGGS PBEF組A549細(xì)胞中AQP1和ENaCα的蛋白表達(dá)水平顯著低于pCAGGS NC組(P<0.05)，而C組、M組、pCAGGS NC組3組A549細(xì)胞中AQP1和ENaCα的蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)合A549細(xì)胞凋亡結(jié)果，可推斷AQP1和ENaC與經(jīng)H/R處理的A549細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。見圖3。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與pCAGGS NC組相比，pCAGGS PBEF組NSCLC A549細(xì)胞中PBEF mRNA增加了約20倍，而PBEF蛋白的表達(dá)僅增加了約30%。PBEF是一種細(xì)胞因子，也是一種分泌蛋白，可以推斷PBEF在A549細(xì)胞中過表達(dá)，大量PBEF蛋白表達(dá)會(huì)分泌到細(xì)胞微環(huán)境中，然后激活分泌細(xì)胞和周圍細(xì)胞的下游途徑，表明A549細(xì)胞具有很強(qiáng)的分泌PBEF的能力，與MING等[23]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下，A549細(xì)胞的凋亡率約為20%，而在相同條件下過表達(dá)PBEF則可以達(dá)到約70%。眾所周知，在NSCLC的治療中，低氧一直是不利因素，因?yàn)榘┘?xì)胞更適合低氧環(huán)境，它們可以變得更具侵襲性，并且對放射療法更具抵抗力[24-25]。以上結(jié)果表明，在低氧條件下，PBEF比正常肺上皮細(xì)胞更能促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，PBEF可能具有輔助治療作用，本研究組將在以后的研究中進(jìn)行探討。XIE等[16-17]研究表明，AQP可能在人類LC中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞中，低氧處理對AQP1和ENaCα的蛋白表達(dá)沒有明顯影響，但是PBEF可以顯著抑制它們的表達(dá)。

據(jù)報(bào)道[26]，在低氧條件下，線粒體釋放的活性氧氮自由基(RONS)可以促進(jìn)ENaCα蛋白的泛素化。也有報(bào)道[27]顯示，高壓氧治療可以促進(jìn)肺表皮細(xì)胞中AQP1的表達(dá)并減輕ALI。本研究結(jié)果表明，NSCLC細(xì)胞中的AQP1和ENaCα對低氧治療相對不敏感，但是這種情況可能會(huì)因PBEF的過表達(dá)而逆轉(zhuǎn)，因此可以推測NSCLC可能受PBEF上游基因的調(diào)節(jié)。總之，本研究可為相關(guān)研究者理解PBEF和NSCLC之間的關(guān)系提供依據(jù)，并為PBEF參與NSCLC的治療提供可能。