馮兆海，石 鑫，郝玉軍，成曉江

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科中心，烏魯木齊 830054)

顱內(nèi)動脈粥樣硬化性狹窄(intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS)是缺血性腦卒中的主要原因之一，常發(fā)生于頸內(nèi)動脈的分支大腦中動脈[1]。據(jù)報道[2]，我國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者中ICAS的發(fā)生率為46.6%，且這類患者的病情往往較重、住院時間相對較長，1年腦卒中復(fù)發(fā)率隨狹窄程度增加而升高。顱內(nèi)動脈斑塊的組成成分和易損性也與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)[3]。易損性斑塊指具有破裂傾向、易導(dǎo)致血栓形成，并可快速進展的粥樣斑塊[3]。目前，大腦中動脈斑塊易損性和狹窄程度的診斷主要依靠影像學(xué)檢查，缺乏有效的血清生物學(xué)指標[4]。miRNA是一類大小約為22個堿基的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。既往研究[5]發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過多種途徑參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，促進頸動脈狹窄，導(dǎo)致腦梗死。有研究[6]顯示，miRNA-19與血管內(nèi)皮細胞凋亡有關(guān)，參與主動脈狹窄的形成過程。本研究探討miRNA-19基因簇編碼的miRNA-19a和miRNA-19b-1與大腦中動脈M1段狹窄程度及斑塊易損性的相關(guān)性，旨在為顱內(nèi)動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年1月至2019年12月收治的符合選擇標準的大腦中動脈M1段狹窄患者80例，其中男49例，女31例；年齡18～72歲，平均(58.37±6.38)歲。另選取數(shù)字減影血管造影(DSA)檢查顯示大腦中動脈M1段正常的同期體檢中心的健康體檢者80例作為對照組，其中男52例，女28例；年齡26～68歲，平均(57.32±10.37)歲。本研究已經(jīng)本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

納入標準：1)DSA檢查明確為大腦中動脈M1段狹窄，其余動脈段正常；2)近1年內(nèi)無急性腦梗死發(fā)生；3)改良Rankin評分<3分。排除標準：1)非動脈粥樣硬化性血管狹窄或閉塞，如動脈炎性病變、煙霧病、動脈夾層等；2)異位血栓脫落導(dǎo)致血管管腔閉塞；3)存在DSA和磁共振成像(MRI)檢查禁忌證；4)合并其他臟器嚴重功能障礙。對照組為同期體檢中心的健康體檢者。

1.2 DSA檢測動脈狹窄程度

所有圖像由2名副主任醫(yī)師雙盲法進行分析，意見不一致時由1名主任醫(yī)師盲法審核確定。顱內(nèi)動脈狹窄程度(%)=(1-狹窄處直徑/狹窄近端正常直徑)×100%。輕度組：狹窄率<50%；中度組：狹窄率50%～70%；重度組：狹窄率>70%[8]。

1.3 高分辨MRI檢測斑塊易損性

采用飛利浦聚源3.0 T磁共振掃描儀(PHILIPS Achieva 3.0T)32通道頭顱線圈進行高分辨磁共振成像(HR-MRI)。采用變翻轉(zhuǎn)角的三維快速自旋回波成像技術(shù)(3D-SPACE)行曲面重建和矢狀位重建。相應(yīng)成像參數(shù)分別為3D-TOF掃描：TR/TE 22/3.69 ms，F(xiàn)OV 200 mm×200 mm，NEX1，矩陣331×384，掃描時間4 min 46 s；DWI掃描：TR/TE 5100/103 ms，F(xiàn)OV 220 mm×220 mm，b=1000 s·mm-2，NEX1，矩陣160×160，層厚5 mm，掃描時間2 min 19 s；TSE3D-T1WI：TR/TE=600/20 ms，F(xiàn)OV=196 mm×196 mm，矩陣320×320，層厚0.6 mm，回波鏈長度28，激勵次數(shù)1.5；TSE3D-T2WI：TR/TE=1300/125 ms，F(xiàn)OV=196 mm×196 mm，矩陣320×320，層厚0.6 mm，回波鏈長度28，激勵次數(shù)1.5；TSE3D-PDWI：TR/TE=1300/21 ms，F(xiàn)OV=196 mm×196 mm，矩陣320×320，層厚0.6 mm，回波鏈長度28，激勵次數(shù)1.5，掃描長度約60層。總掃描時間為：29 min 15 s。所有圖像由2名副主任醫(yī)師雙盲法進行分析，意見不一致時由1名主任醫(yī)師盲法審核確定。以T1WI為基礎(chǔ)，參照橫斷面原始TOF及T2WI圖像，觀察斑塊及管壁的形態(tài)、位置和大小。

參考UNDERHILL等[7]研究，根據(jù)斑塊易損性將患者分為高危組、中危組和低危組。低危組：斑塊負荷<2 mm，或若斑塊負荷>2 mm，但脂質(zhì)核比例(脂質(zhì)核面積/血管壁面積)<20%；中危組：斑塊負荷>2 mm，脂質(zhì)核比例為20%～40%；高危組：斑塊負荷>2 mm，且脂質(zhì)核比例>40%。

1.4 qPCR法檢測血清miRNA

采集患者晨起空腹肘靜脈血5 mL，2500 r·min-1、4 ℃離心15 min，收集上層血清。采用Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計測量吸光度值(A260/A280)，當吸光度值為1.8～2.2時繼續(xù)下一步實驗。本研究引物由北京康維世紀公司合成并提供，引物序列見表1。用miScript Ⅱ RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國凱杰公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，最后加入去離子水稀釋。隨后用miScrpt SYBR Green試劑盒(德國凱杰公司)進行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：加熱95 ℃ 30 min，變性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。本研究以U6為內(nèi)參，用2-△△Ct公式計算miRNA-19a和miRNA-19b-1的相對表達量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組基線資料的比較

動脈狹窄輕度組、中度組、重度組與對照組基線資料的比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。斑塊易損性高危組、中危組、低危組與對照組的基線資料比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表2 各組基線資料的比較(基于動脈狹窄程度分組)

表3 各組基線資料的比較(基于斑塊易損性分組)

2.2 2組血清miRNA-19a和miRNA-19b-1水平比較

病例組血清miRNA-19a和miRNA-19b-1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表4。

表4 2組血清miRNA-19a和miRNA-19b-1水平比較

2.3 miRNA-19a和miRNA-19b-1與動脈狹窄程度的關(guān)系

輕度組、中度組和重度組血清miRNA-19a和miRNA-19b-1的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。見表5。Spearman分析結(jié)果顯示，miRNA-19a和miRNA-19b-1與狹窄程度呈正相關(guān)(r=0.826、0.795，P<0.05)。

表5 miRNA-19a和miRNA-19b-1與動脈狹窄程度的關(guān)系

2.4 miRNA-19a和miRNA-19b-1與斑塊易損性的關(guān)系

低危、中危和高危組血清miRNA-19a和miR-NA-19b-1的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。見表6。Spearman分析結(jié)果顯示，miRNA-19a和miRNA-19b-1與斑塊易損危險性呈正相關(guān)(r=0.701、0.658，P<0.05)。

表6 miRNA-19a和miRNA-19b-1與斑塊易損性的關(guān)系

2.5 miRNA-19a、miRNA-19b-1預(yù)測高危斑塊的價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-19a和miRNA-19b-1預(yù)測高危斑塊的AUC分別為0.774和0.685，二者聯(lián)合檢測可將AUC提高至0.814。見圖1和表7。

表7 miRNA-19a、miRNA-19b-1預(yù)測高危斑塊的價值

3 討論

ICAS可促進缺血性腦卒中的發(fā)生，動脈粥樣硬化斑塊破裂是ICAS繼發(fā)腦缺血事件的高危因素。掌握易損斑塊特點，盡早識別高風(fēng)險易損斑塊，對腦卒中的篩查和預(yù)防有重要意義。傳統(tǒng)影像學(xué)檢查如DSA、CT血管造影、經(jīng)顱多普勒等，只能通過直接或間接手段評估顱內(nèi)動脈管腔閉塞情況或者狹窄程度，并不能反映斑塊真實信息[9]。本研究結(jié)果證實，miRNA-19基因簇編碼的miRNA-19a和miRNA-19b-1與大腦中動脈M1段狹窄程度及斑塊易損性密切相關(guān)。

miRNA是非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。miRNA廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡和代謝等生物學(xué)過程，在免疫炎癥和氧化應(yīng)激中起著重要作用[10]。miRNA與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。既往研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調(diào)節(jié)X連鎖凋亡抑制蛋白、水通道蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子和超氧化物歧化酶等調(diào)節(jié)頸動脈狹窄的發(fā)生及發(fā)展過程。也有學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)，miRNA可能作為頸動脈狹窄的生物學(xué)標志物。例如，GACON等[13]發(fā)現(xiàn)外周血miRNA-208b-3p、miRNA-34a-5p和miRNA-499-5p是頸動脈狹窄的影響因素。miRNA-19位于染色體13q31第3個內(nèi)含子C13orf25上，編碼miRNA-19a和miRNA-19b-1。既往研究[14]發(fā)現(xiàn)，miRNA-19a和miRNA-19b-1與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。陳泓穎等[15]發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠血清miRNA-19b-1水平明顯升高，miRNA-19b抑制劑可以減少巨噬細胞的凋亡，下調(diào)炎癥細胞因子水平，減少由于動脈粥樣硬化引起的血管厚度的增加。本研究檢測了80例大腦中動脈M1段狹窄患者血清中miRNA-19a和miRNA-19b-1的表達，其表達水平明顯高于對照組，表明miRNA-19a和miRNA-19b-1可能是大腦中動脈狹窄的影響因素，同時提示miRNA-19a和miRNA-19b-1可能參與了顱內(nèi)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

HR-MRI可有效辨別動脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)成分，對評估斑塊穩(wěn)定性有一定價值[16]。本研究根據(jù)HR-MRI檢查結(jié)果將80例大腦中動脈M1段狹窄患者分為高危組、中危組和低危組。研究結(jié)果顯示，高危組血清miRNA-19a和miRNA-19b-1高于中危組和低危組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Spearman分析結(jié)果顯示，miRNA-19a和miRNA-19b-1與斑塊易損危險性呈正相關(guān)，表明miRNA-19a和miRNA-19b-1與大腦中動脈M1段斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。本研究采用ROC曲線預(yù)測高危斑塊的發(fā)生，結(jié)果顯示miRNA-19a和miRNA-19b-1預(yù)測高危斑塊的AUC分別為0.774和0.685，說明預(yù)測價值較高，而二者聯(lián)合檢測可提高AUC，并增加預(yù)測的靈敏度和特異度，提示聯(lián)合檢測血清miRNA-19a和miRNA-19b-1對評估高危斑塊具有更好的價值。

綜上所述，大腦中動脈M1段狹窄患者血清miRNA-19a和miRNA-19b-1表達水平明顯升高，可能是動脈狹窄的影響因素；另外，miRNA-19a和miRNA-19b-1與斑塊易損性密切相關(guān)，對高危斑塊的診斷有一定價值。但是本研究存在一定的局限性：1)本研究未分析miRNA-19a和miRNA-19b-1與其他動脈粥樣硬化生物學(xué)指標的關(guān)系，如炎癥細胞因子；2)未對患者進行長期隨訪。因此，miRNA-19a和miRNA-19b-1與ICAS的確切關(guān)系仍需要未來進一步探討。