段佳琪 李琲琲 任杰 邱德文 李廣悅

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所 吉林省資源昆蟲產(chǎn)業(yè)化工程中心，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是鐮刀菌侵染大麥、小麥、玉米等谷物后產(chǎn)生的一種真菌毒素，最早在1970年由諸罔信一等人從感染赤霉病的大麥中分離獲得［1］。DON屬于單端孢霉烯族毒素，分子式為C15H20O6（圖1）［2］，能夠抑制蛋白質(zhì)合成［3］，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，是毒性較大的真菌毒素之一，并且能與其他毒素產(chǎn)生毒性增效作用［4-5］。最新的研究表明，長期暴露在低劑量DON下，人和動物會產(chǎn)生慢性不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［6-9］；而人畜一旦攝入過量的DON污染的食物后，會出現(xiàn)急性中毒癥狀，嚴(yán)重時甚至造成死亡［10-11］。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的分子結(jié)構(gòu)

鑒于DON在糧食、飼料和食品中污染的普遍性及其對人畜健康危害的嚴(yán)重性，系統(tǒng)研究DON的致毒機(jī)理、檢測方法和脫毒方法尤為迫切和重要。獲得大量的高純度的標(biāo)準(zhǔn)品是進(jìn)行DON相關(guān)研究的基礎(chǔ)和保障，然而由于DON結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)的特殊性，其高效的化學(xué)合成仍然面臨挑戰(zhàn)［12］，因此目前市售的DON標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，阻礙了DON相關(guān)研究的開展。禾谷鐮刀菌發(fā)酵結(jié)合后續(xù)的分離純化是目前獲取大量高純度DON的最有效的方法，國內(nèi)外的研究人員對此工藝進(jìn)行了大量的研究和改進(jìn)。在培養(yǎng)基的選擇上，多使用大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基，也有利用小麥和玉米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基的報道［13-15］；在DON的分離純化方面，多采用柱層析技術(shù)，配合HPLC和高速逆流色譜技術(shù)，輔以重結(jié)晶的手段，達(dá)到分離純化DON的目的［14-19］。柱層析技術(shù)操作繁瑣，耗時耗力，對操作人員的要求較高，同時需要大量的有機(jī)試劑，成本較高。高速逆流色譜價格昂貴，一般常規(guī)實驗室無法配備。因此，為了有效推進(jìn)DON的相關(guān)研究，尤其是針對缺乏化學(xué)分離經(jīng)驗的實驗室，仍需開發(fā)一套簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的DON制備方法。

本研究充分利用了DON與其他雜質(zhì)物化特性的差異，開發(fā)了一套簡單經(jīng)濟(jì)的“抽提-凈化-精制-純化”四步DON純化制備方法，使用該方法可以從每千克PH-1的大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。此外，該方法的優(yōu)勢還在于對于缺乏昂貴實驗設(shè)備和化學(xué)分離經(jīng)驗的實驗室，經(jīng)過精制的DON純度已經(jīng)達(dá)到80%以上，可以滿足常規(guī)研究的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 禾谷鐮刀菌PH-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張昊老師惠贈；DON標(biāo)準(zhǔn)品：購自青島普瑞邦生物工程有限公司；大米：購自北京市興創(chuàng)科源生物技術(shù)有限公司；甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、石油醚（60-90℃）：購自北京市通廣精細(xì)化工有限公司；乙腈（分析純）、氯化鈉：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；純凈水：購自杭州娃哈哈基團(tuán)有限公司；無水硫酸鈉：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；滅菌袋：購自北京威萊博生物技術(shù)有限公司。

1.1.1.1 PDA培養(yǎng)基 稱取200.0 g去皮土豆，小塊，沸水煮20 min，使用8層紗布濾得濾液，在濾液中加入葡萄糖20.0 g，并使用蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻后分裝到500 mL錐形瓶中，每個錐形瓶加入200 mL濾液和3.0 g瓊脂，121℃滅菌15 min。

1.1.1.2 產(chǎn)毒培養(yǎng)基 大米100.0 g裝入滅菌袋中，加入20 mL蒸餾水，充分混勻后使用16層紗布封口以保證透氣性，121℃滅菌15 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備 LD-Y300A高速萬能粉碎機(jī)：上海頂帥電器有限公司；HPS-200B生化培養(yǎng)箱、DLCJ-2NDI超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RE-52-3-5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；水式真空泵：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LTCPS80C立式壓力蒸汽滅菌鍋：立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-400DE超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；高效液相色譜儀Agilent Infinity 1260 HPLC、色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Semi-Prep（9.4 mm×250 mm，5 μm）：美國Agilent公司；色譜柱Waters XBridge C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）：美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 DON檢測方法的建立 使用Agilent Infinity 1260 HPLC對DON的含量進(jìn)行檢測。檢測條件如下：上樣量：20 μL；流動相：水和甲醇（色譜純）（80∶20，V/V），等度洗脫，使用前過0.2 μm濾膜并超聲脫氣；流速：0.8 mL/min；色譜柱：Waters XBridge C18 色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；柱溫：30℃；檢測波長：218 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用純凈水將DON標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，分別配制濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測定，建立DON含量與峰面積的回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵 將禾谷鐮刀菌PH-1接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周左右至菌絲長滿平板。使用直徑8 mm的打孔器沿菌落邊緣打制菌餅，確保菌餅菌絲生長狀態(tài)一致。將菌餅分別接種至小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中，每袋培養(yǎng)基接種5個菌餅，揉捏接種菌餅的培養(yǎng)基，使菌絲混勻在培養(yǎng)基中。在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天揉捏培養(yǎng)基，保證培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。每7 d取樣一次，監(jiān)測DON的含量變化。

1.2.4 DON提取劑的選擇及DON產(chǎn)量的檢測 將樣品在60℃的烘箱中烘干，粉碎后過50目篩，分別加入5倍質(zhì)量體積比的乙腈-水（84∶16，V/V）、甲 醇-水（9∶1，V/V）、甲 醇-水（8∶2，V/V）甲醇-水（7∶3，V/V），置于30℃恒溫?fù)u床中，200 r/min振蕩24 h。取粗提液過0.22 μm濾膜后進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.5 粗毒素的提取 選擇培養(yǎng)28 d的樣品制備DON，乙腈-水（84∶16，V/V）作為提取劑，提取方法同1.2.4。減壓抽濾獲得粗提液，將粗提液濃縮至膏狀，待下一步分離使用。

1.2.6 粗毒素的凈化 （1）使用原粗提液1/10體積的提取劑重新溶解粗毒素并過濾除去不溶性雜質(zhì)。（2）在濾液中加入等體積石油醚，振蕩5 min，靜置分層，取下層乙腈-水相，重復(fù)操作3次以充分除去脂類物質(zhì)。（3）在乙腈-水相中加入NaCl至飽和，振蕩5 min，靜置分層，取上層乙腈相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加入等體積乙腈重新溶解，過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì)；再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加入

等體積蒸餾水重新溶解。

1.2.7 DON的精制 （1）水相中加入等體積乙酸乙酯-石油醚（1∶1，V/V），振蕩5 min，靜置分層，取下層水相，重復(fù)操作3次。（2）向水相加入NaCl至飽和，再加入等體積乙酸乙酯，振蕩5 min，靜置分層，取上層乙酸乙酯相，重復(fù)操作3次；合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加入等體積乙酸乙酯重新溶解，過0.45 μm濾膜除去不溶性雜質(zhì)。再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加入1/10體積蒸餾水重新溶解，并過0.22 μm濾膜，待進(jìn)一步純化用。

1.2.8 DON的純化 使用制備型高效液相色譜做進(jìn)一步純化，條件如下：流動相∶水和甲醇（色譜純）（80∶20，V/V），等度洗脫；流速：4 mL/min；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（9.4 mm ×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；檢測波長：218 nm。合并收集的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后于-20℃保存。

1.2.9 DON的定量及純度鑒定 使用HPLC檢測純化產(chǎn)物中DON濃度，同時在200-950 nm的范圍內(nèi)對其進(jìn)行全波長掃描；將純化產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，氘代甲醇重新溶解，1H-NMR檢測分子結(jié)構(gòu)，鑒定DON純度。

2 結(jié)果

2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用Agilent Infinity 1260 HPLC分別檢測濃度為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液，以DON濃度為橫坐標(biāo)，DON的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y= 28.332x - 4.5289，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 8。此檢測方法在1 mg/L-50 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.2 禾谷鐮刀菌PH-1的固態(tài)發(fā)酵

在固態(tài)發(fā)酵之前，首先通過預(yù)實驗測定了大米和小麥兩種培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量和比例均高于小麥培養(yǎng)基，DON產(chǎn)量為41.9 mg/kg，占粗毒素的2.7%。進(jìn)一步測定了大米培養(yǎng)基中含水量（10%-60%）對DON產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明連續(xù)培養(yǎng)14 d后含水量為20%的大米培養(yǎng)基中DON產(chǎn)量最高，為61.2 mg/kg。因此后續(xù)實驗中，選用含水量20%的大米培養(yǎng)基作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基。

為了監(jiān)測禾谷鐮刀菌發(fā)酵過程中DON產(chǎn)量的動態(tài)變化，在接菌7 d、14 d、21 d、28 d及35 d后取樣并測定樣品中DON的含量。接種禾谷鐮刀菌不同時間后培養(yǎng)物的狀態(tài)發(fā)生了明顯的變化，培養(yǎng)基中大米由最初的顆粒狀變成了越來越細(xì)小的粉末狀，同時顏色也越來越深（圖 2），說明禾谷鐮刀菌能夠充分利用大米培養(yǎng)基中的營養(yǎng)進(jìn)行生長，并在此過程中產(chǎn)生了大量色素。

圖2 接種禾谷鐮刀菌PH-1的大米培養(yǎng)基在發(fā)酵0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d后的狀態(tài)

與培養(yǎng)物狀態(tài)變化相對應(yīng)的是DON的含量也發(fā)生了明顯的變化（圖 3），在連續(xù)25℃恒溫培養(yǎng)的35 d過程中，DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在28 d時達(dá)到最高（259.47 mg/kg），因此后續(xù)實驗選擇接種28 d后的產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行DON的分離和純化。至于為何DON的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，推測這與禾谷鐮刀菌自身的代謝變化密切相關(guān)，但其具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

2.3 DON粗毒素的提取

圖3 禾谷鐮刀菌PH-1的產(chǎn)毒曲線

為了比較不同提取劑的提取效果，以84%乙腈的提取率為100%，計算不同比例的甲醇-水溶液的提取率，同時對粗提液的峰面積進(jìn)行歸一化處理，計算DON占粗提液的比例（表1）。研究結(jié)果表明90%甲醇（圖4-C，表1）的DON提取率極低，僅為22.7%，80%甲醇（圖4-D）和70%甲醇（圖4-E）與84%乙腈（圖 4-B）提取效率相當(dāng)（表1），但是雜質(zhì)的含量明顯增多（表1），給后期的分離純化工作帶來挑戰(zhàn)。因此本研究選擇了文獻(xiàn)中報道最多的84%乙腈作為DON提取劑。

2.4 DON的分離

從圖5-A可知，粗毒素中含有大量的雜質(zhì)，DON含量僅為2.9%（表1）。因此，首先利用石油醚、乙腈以及飽和NaCl溶液三者不互溶的特性，去除一部分雜質(zhì)，凈化粗毒素。圖5-B為凈化后的粗毒素，與凈化前相比雜質(zhì)的含量降低了一個數(shù)量級，4 min、5 min位置附近的雜質(zhì)更是降低到原來的1%左右；DON的比例上升至20.1%，且總量沒有明顯的損失。

凈化后粗毒素中仍然存在大量雜質(zhì)，需要再次進(jìn)行了雜質(zhì)去除操作。圖5-C為再次去除雜質(zhì)后的色譜圖，與圖5-B相比，4 min、5 min位置的雜質(zhì)成功去除，2 min位置雜質(zhì)減少50%。DON在乙酸乙酯和飽和NaCl溶液中的分配比為3.3∶1，采用乙酸乙酯3次萃取后，2-4 min的雜質(zhì)幾乎都留在水相中（圖5-D），DON已經(jīng)全部轉(zhuǎn)移到有機(jī)相（即乙酸乙酯）中（圖5-E），經(jīng)過精制的DON純度達(dá)到81.5%。

表1 不同提取劑提取效果對比

圖4 不同溶劑提取液色譜圖

圖5 不同分離階段色譜圖

2.5 DON的純化及純度鑒定

雖然精制后的DON已經(jīng)去除大部分雜質(zhì)，但是依舊不能獲得DON純品，利用制備型HPLC進(jìn)一步純化，收集餾分獲得純化后的DON。使用分析型HPLC對純化產(chǎn)物檢測，利用軟件對產(chǎn)物峰積分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，計算得DON為61.4 mg，即1 kg產(chǎn)毒培養(yǎng)基可獲得61.4 mg DON純品。

對純化產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果如圖6-A所示：純化樣品的出峰時間與DON標(biāo)準(zhǔn)品（圖4-A）一致；樣品DON色譜峰純度大于99%，全波長掃描顯示最大吸收波長在220 nm（圖6-B），與DON一致；1H-NMR檢測結(jié)果為：1H NMR（CD3OD），δ：1.127（s，3H），1.848（s，3H），1.842（t，1H），2.442（dd，1H），3.069（dd，2H），3.542（d，2H），3.685（dd，2H），4.357（m，1H），4.814（s，1H），4.954（d，1H），6.608（dd，1H）。HPLC與1H-NMR結(jié)果證明獲得的是DON純品。

圖6 純化產(chǎn)物純度分析

3 討論

近年來，隨著全球環(huán)境的惡化，氣候異常導(dǎo)致的病害大爆發(fā)時常發(fā)生，我國部分地區(qū)小麥赤霉病呈逐年上升趨勢［20-21］。赤霉病不僅會導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低，還會產(chǎn)生大量的DON，導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降甚至不能作為食物或者飼料使用，造成嚴(yán)重?fù)p失［22］。DON能夠破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)、影響線粒體功能以及抑制蛋白質(zhì)的合成［23］；若長期暴露在低劑量DON環(huán)境中，能夠引起胚胎發(fā)育缺陷以及畸形發(fā)育［24］；若人、畜、禽等誤食DON，輕則會產(chǎn)生惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，重則中毒死亡［25］。為了獲得大量高純度的DON用于科學(xué)研究，國內(nèi)外科研團(tuán)隊進(jìn)行了大量探索，希望開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效的DON的制備方法。

目前，DON主要通過禾谷鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)生，小麥、大米、玉米是最常用的產(chǎn)毒培養(yǎng)基。陸鳴等［13］測試了不同培養(yǎng)基對DON產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明小麥培養(yǎng)基產(chǎn)毒最高；玉米次之；大米最低，但是就DON在粗毒素中的比例而言，大米最高；小麥次之。本研究測試了禾谷鐮刀菌在小麥培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中發(fā)酵的DON產(chǎn)量情況，結(jié)果與陸鳴的研究結(jié)果有出入，可能是菌種差別的原因。徐得月等［26］預(yù)測水分和培養(yǎng)時間為產(chǎn)毒的關(guān)鍵影響因子，但是文獻(xiàn)中對于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中水分的描述并不明確，本研究測試培養(yǎng)基含水量對DON產(chǎn)量的影響以及DON產(chǎn)量隨時間的變化情況，研究結(jié)果表明禾谷鐮刀菌PH-1接種到含水量20%的大米培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28 d時DON產(chǎn)量最高。

在DON的分離純化方面，洪淑娟等［27］使用甲醇作為粗毒素提取劑，利用高速逆流色譜純化DON，從300 g大米培養(yǎng)基中僅得到8 mg DON，純度97.7%。該方法雖然簡單，但是提取純化效率低。Clifford［16］使用70%甲醇作為粗毒素提取劑采用硅膠柱層析的方法，使用正己烷-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，并經(jīng)過結(jié)晶和重結(jié)晶，最終獲得DON純度>99%。Zhao等［15］使用84%乙腈作為粗毒素提取劑，采用兩次硅膠柱層析和HPLC純化的方法，該方法操作繁瑣，對實驗人員的技術(shù)要求較高。姜云晶等［14］使用兩次硅膠柱層析和重結(jié)晶的方法，存在的問題和Zhao等［15］類似。郭文博等［19］利用自制前處理凈化小柱除雜，制備液相純化DON的方法。前處理凈化小柱相對于硅膠柱，技術(shù)門檻更高，而且更適合應(yīng)用于DON的分析檢測。

無論是使用高速逆流色譜、高效液相色譜，還是重結(jié)晶的方法純化DON，其樣品的前處理工作大多采用柱層析的方法除去多余的雜質(zhì)，凈化DON。根據(jù)DON的理化特性，本研究探索了DON在不同混合溶劑中的分配比例，研究結(jié)果表明DON在等體積乙腈和飽和NaCl溶液中分配比接近1∶1，在等體積乙酸乙酯和水中分配比接近0∶1。基于以上研究結(jié)果，本研究使用經(jīng)典方式凈化DON粗毒素后，加入“精制”這一過程，用以替代其他研究者報道的硅膠柱層析步驟。精制后的DON純度達(dá)到80%以上，這已經(jīng)能夠滿足常規(guī)研究的需求，例如DON降解菌的初步篩選等。在使用HPLC做最后純化時，較高純度的DON可以有效提高純化效率，降低的色譜柱的損耗，降低分離純化的成本。

4 結(jié)論

本研究以大米作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基，采用液液萃取分離結(jié)合HPLC純化的方法，建立了一套從DON發(fā)酵、分離到純化的系統(tǒng)方法，利用該方法從每千克大米培養(yǎng)物中獲得61.4 mg DON純品。