劉俊 金鈺 吳耀松 劉燕 王文彬 任閃閃 刁松鋒 陳玉龍

（1. 河南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥科學院 河南省中醫(yī)方證信號傳導重點實驗室，鄭州 450046；2. 河南省林業(yè)科學研究院，鄭州 450008；3. 中國林業(yè)科學院經(jīng)濟林研究所 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心 經(jīng)濟林種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，鄭州 450003）

轉錄因子又稱反式作用因子，是一類能夠專一性結合目的基因上游特異核苷酸序列，并具對靶基因有激活或抑制功能的一類含有特殊結構的蛋白。根據(jù)轉錄因子對其他基因的調(diào)控關系，植物的反式作用因子可以分為兩類，一類可以非選擇性地調(diào)控基因的轉錄表達，稱之為非特異性轉錄因子；另一類可以特異性調(diào)控下游因子的轉錄翻譯。根據(jù)轉錄因子結合域的類型分為不同的基因家族，同時依據(jù)保守域的數(shù)目及保守域外的功能域，基因家族又分為不同的亞家族［1-2］，如Dof、MYB、MADS、LBD、SAUR、GRF、bHLH、KNOX、WRKY和NAC轉 錄因子家族等。

1 Dof轉錄因子在植物基因組中的分布

ZmDof1是第一個從玉米中克隆出來的Dof基因［3］，隨著人們對轉錄因子的關注和深入研究，更多的Dofs基因從其他物種的基因組數(shù)據(jù)庫中相繼被預測或克隆出來。隨著基因組學和分子生物學的發(fā)展，無論是在高等植物還是在單細胞藻類中發(fā)現(xiàn)均有Dof轉錄因子家族，但是不同物種中數(shù)量差異較大。本文對已報道的不同物種中Dof轉錄因子的數(shù)目進行了統(tǒng)計，結果如表1所示。

2 Dof轉錄因子的結構特點

DNA結 合 單 鋅 指（DNA binding with one zinc finger，Dof）蛋白是植物特有的轉錄因子家族之一，屬于C2C2單鋅指蛋白超家族，因富含一個特別的Cys殘基的單鋅指保守結構域，稱為Dof結構域［37］。Dof蛋白通常由200-400個核苷酸殘基組成，只含有一個拷貝的Dof保守域和兩個結構域組成，N末端高度保守的DNA結合結構域和C尾端轉錄調(diào)控域［2，38-41］。結合結構域（Binding domain，BD）是一段高度保守的，由52個氨基酸殘基組成的Dof結構域，在此結構域中CX2CX21CX2C基序形成一個單鋅指結構，單鋅指結構中4個保守的Cys殘基與1個Zn2+共價結合［2，42-44］，一個發(fā)生變化，均會導致Dof蛋白活性的喪失，DNA結合結構域能與其他蛋白結合，發(fā)生相互作用，是具有重要作用的功能域［45］。由于Dof蛋白的DNA結合域序列保守性較強，所以它們都有著相似的DNA結合特性［46］。C端包含一個具有多種功能的轉錄調(diào)控結構域，能與多種調(diào)控蛋白相互作用和激活基因表達［26］，該結構域氨基酸保守性較差，不同Dof成員之間變異很大，進而導致Dof蛋白功能的多樣性。Dof蛋白的N端和C端區(qū)域可與多種調(diào)控蛋白或攔截信號相互作用，激活或抑制下游調(diào)控因子［47-48］。

表1 不同物種中Dof基因的分布［4］

3 Dof 轉錄因子的功能

Dof蛋白是只存在于植物體內(nèi)的一類反式作用因子［49］，擁有豐富的功能。研究表明，Dof轉錄因子參與植物的生長調(diào)控、信號傳導、種子萌發(fā)、光周期響應、非生物脅迫及開花調(diào)控等多種生物學途徑［50-55］。

3.1 生長發(fā)育

Dof蛋白參與植物的多種生長發(fā)育［56］。在擬南芥中，OBP結合蛋白1（OBF binding protein 1，OBP1）蛋白作為Dof轉錄因子家族成員之一，是首先被報道出來的OCS元件結合因子（OCS element binding factor，OBF），OBP1的過表達導致了細胞周期相關基因顯著上調(diào)表達，染色質免疫沉淀實驗證實，OBP1的直接靶點至少包括核心細胞周期基因CYCD3；3和復制特異性轉錄因子基因AtDOF2.3；OBP1在細胞培養(yǎng)中的短期激活影響了細胞周期的重新進入，縮短了G1期的持續(xù)時間和細胞周期的總長度，OBP1組成性過表達則影響了細胞的大小和細胞數(shù)量，導致植株矮化；在胚胎發(fā)生、萌發(fā)和側根起始階段的表達表明，OBP1在細胞周期的重新進入中起著重要的作用，是關鍵細胞周期基因的轉錄調(diào)控因子［57］。過表達AtDOF5.4/OBP4通過促進內(nèi)循環(huán)的早期發(fā)生，抑制細胞的擴增，降低了轉基因擬南芥細胞的大小和數(shù)目，導致轉基因植株矮小。因此，OBP4（OCS element binding factor，OBF4）作為一個負調(diào)控因子，調(diào)節(jié)擬南芥細胞的擴張和細胞周期進程［58］，并且OBP4通過與根毛缺陷型RSL2（ROOT HAIR DEFECTIVE6-LIKE2）基因的啟動子結合，抑制RSL2的轉錄，有助于抑制擬南芥根毛依靠脫落酸（Abscisic acid，ABA）的生長［59］。AtDof2.4啟動子在葉片原核、根和胚的原形成層細胞中均有活性，而AtDof5.8啟動子活性在幼苗葉片原核、發(fā)育胚胎的子葉和發(fā)育花芽的維管組織的前緣靜脈細胞中均有特異性表達，表明AtDof2.4和AtDof5.8在擬南芥不同生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同作用［42，60］；AtDof6的轉錄水平在干燥的種子中積累，在催熟和種子吸脹時逐漸衰減。研究表明，AtDof6對種子萌發(fā)起負調(diào)控作用，ABA超敏表型以及ABA生物合成基因ABA1和ABA相關脅迫基因的表達增加，酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗結果顯示，AtDof6可以與種子萌發(fā)陽性調(diào)節(jié)因子TCP14發(fā)生蛋白互作。在TCP14突變體中，ABA1和與ABA相關的應激基因的表達也增強，表明AtDof6對種子萌發(fā)起負調(diào)控作用，并與TCP14對一組特定的ABA相關基因的調(diào)控功能相違背［61］。AtDof5.6/HCA2（high cambial activity 2）優(yōu)先在各器官的維管系統(tǒng)中表達，尤其在花序莖的形成層、韌皮部和束間薄壁細胞中，進一步研究表明，HCA2促進束間形成層在花序梗發(fā)育的早期階段形成。由此表明AtDof5.6/HCA2參與了擬南芥束間形成層的形成和維管組織發(fā)育的調(diào)控［62］；AtDof4.7基因在擬南芥的長角果和里層中豐富表達，過表達AtDof4.7基因導致翼瓣和雄蕊的脫落時間明顯推遲，進而影響花器官的脫落［2］，表明AtDOF4.7作為轉錄復合物的一部分參與脫落的控制，直接調(diào)控細胞壁水解酶的表達［63］；Dof2.1通過MYC2-Dof2.1-MYC2前饋轉錄環(huán)作為JA誘導葉片衰老的增強劑，促進擬南芥葉片衰老［64］。在小麥中，Dof轉錄因子小麥醇溶一谷蛋白盒結合因子（Wheat prolamin-box binding factor，WPBF）是從小麥胚乳中分離到的一種DOF轉錄因子，蛋白質體外結合實驗和雙分子熒光互補實驗結果證明，WPBF可以與TaQM發(fā)生相互作用，并且TaQM的表達模式與WPBF相似；在轉基因擬南芥的種子和維管系統(tǒng)中觀察到了WPBF基因的啟動子活性，這與WPBF在小麥中的表達譜一致。由此表明，WPBF不僅在小麥種子發(fā)育過程中起作用，在其他生長發(fā)育過程中也起作用，具有功能的多樣性［65］。番茄中，SlDOF10參與維管組織的發(fā)育，并且在生殖發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［66］；SlDof1在高度富含保衛(wèi)細胞的表皮中表達，凝膠阻滯實驗顯示，SlDof1能夠與特異的TAAAG基序相互結合，該結果為TAAAG元件是調(diào)控細胞特異性基因表達的Dof蛋白的靶位點提供了證據(jù)［67］。超表達35S∷SlCDF3通過提高光合作用和糖的利用，提高了轉基因番茄植株的生物產(chǎn)量，轉錄組分析顯示，CDF3（CYCLING DOF FACTOR 3）基因參與調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)、光合作用性能和初級代謝相關基因的表達，進而提高生物產(chǎn)量［68］。在大豆中，過表達GmDof11顯著增加了轉基因植株的分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)和百粒重，并提高了種子含油量及大豆的產(chǎn)量［42，69］。OsDof24和OsDof25能夠調(diào)節(jié)水稻種子中貯藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表達［70］；過表達OsDof12減少轉基因水稻主支和側支的數(shù)目、降低植株高度、葉片直立變短、小穗長度變小。由此說明，OsDof12參與水稻植株結構的形成［71］。

3.2 碳氮代謝

在玉米中，ZmDof1（MNB1a）不僅誘導磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenol pyruvate carboxylase，PEPC）和正磷酸雙激酶（cyPPDK）基因的表達，調(diào)控氮的代謝［41，72］，而且超表達ZmDof1導致轉基因擬南芥氮含量提高30%［44］；過量表達ZmDOF36導致轉基因玉米淀粉結構異常，淀粉合成相關基因上調(diào)表達，玉米淀粉含量增加，可溶性糖和還原糖含量降低，酵母單雜交結果顯示，ZmDOF36可以直接調(diào)控ZmAGPS1a、ZmAGPL1、ZmGBSSI、ZmSSIIa、ZmISA1和ZmISA3基 因 轉 錄［73］；ZmDof3在 體 內(nèi)外均可與淀粉生物合成基因Du1和Su2啟動子中的Dof核心元件結合。進一步分析表明，ZmDof3的敲除降低了參與糊粉細胞分化的Nkd1的表達，ZmDof3可以與Nkd1啟動子的Dof核心元件結合，表明ZmDof3在玉米胚乳發(fā)育過程中起著正向調(diào)節(jié)作用，在調(diào)控淀粉積累和糊粉蛋白發(fā)育的信號系統(tǒng)中起著積極的調(diào)節(jié)作用［74］。OsDof13是ZmDof1的同源基因，該基因也參與低氮脅迫響應［37］，OsDOF18通過誘導水稻根系中氨轉運體來控制植株對氨的吸收［75］。豌豆中，PsDof7基因參與碳代謝，在葡萄糖處理下該基因上調(diào)表達［76］。在甘薯中，超量表達Dof類轉錄因子SRF1通過對液泡轉化酶基因的負調(diào)控，調(diào)節(jié)貯藏根的碳水化合物代謝，增加淀粉鮮重在轉基因植株中含量，顯著降低了葡萄糖和果糖所占比重［41，77］。綜上所述，Dof轉錄因子在植物碳氮代謝中發(fā)揮了重要作用。

3.3 非生物脅迫

大量研究表明，Dof轉錄因子參與植物的非生物脅迫等抗性反應［47，78］。在擬南芥中，MeJA誘導AtDof1.1基因的表達，表達量上調(diào)2-3倍［79-80］，ATDOF5.8通過調(diào)控質膜結合NAC蛋白ANAC069來參與鹽脅迫響應［81］，CDF3基因的表達受高鹽、干旱、高溫和ABA的誘導，過表達CDF3提高轉基因擬南芥干旱、低溫和滲透脅迫的耐受程度，縮短轉基因植株的開花時間。然而，缺失表達CDF3（cdf3-KO）引起轉基因植株抗性減弱，CDF3可以調(diào)控細胞滲透和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）穩(wěn)態(tài)相關基因表達，通過多跨膜結構蛋白GI（GIGANTEA）調(diào)節(jié)應答植物中糖和氨基酸水平的變化，由此說明，擬南芥CDF3基因在非生物脅迫中發(fā)揮了多重作用［82］。在番茄中，SlCDF1-5是擬南芥CDFs的同源基因，在干旱、鹽、熱和低溫處理后，出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達，表明SlCDF1-5參與非生物脅迫響應；將SICDF1和SICDF3轉入擬南芥，提高了轉基因植株的抗旱能力［83］。二穗短柄草中，BdCBF1、BdCBF2和BdCBF3通過調(diào)節(jié)下游靶基因Dhn5.1（DEHYDRIN5.1）和冷相關COR（COLDREGULATED），在寒冷、干旱和鹽脅迫中發(fā)揮重要作用［84］。TaDofs參與小麥顆粒發(fā)育及非生物脅迫響應，TaDof16、TaDof26和TaDof96在干旱脅迫處理下分別上調(diào)2倍、7倍和12倍［85］；在大白菜中，大部分的BraDofs基因的表達受到冷、熱、高鹽度和干旱脅迫的誘導。過表達GhDof1轉基因棉花的耐鹽性和耐寒性明顯高于野生型，鹽脅迫促進GhDof1超表達植株根系的生長，應激反應基因GhP5CS、GhSOD和GhMYB在轉基因株系中的表達水平均有不同程度的上調(diào)，部分轉基因植株油含量增加，蛋白質含量降低，表明GhDof1是提高陸地棉非生物脅迫耐受性和籽油含量的功能轉錄因子［86］。在楊樹中，7個基因（PtrDof14、16、25、27、28、37和39）在ABA和滲透脅迫下，在葉片和根中持續(xù)上調(diào)表達，PtrDof27和PtrDof28在ABA處理中的葉片和根組織中，與擬南芥的同源基因（AT5G66940）具有相似的表達模式，表達量均得到了提高［87］。在剛毛檉柳中，ThDof1.4通過提高脯氨酸水平，增強ROS的清除能力，同時調(diào)控ThSODs、ThPODs、ThP5CS1和ThP5CS2基因的表達，顯著提高了轉基因植株非生物脅迫耐受性［88］。

3.4 開花調(diào)控

Dof轉錄因子還參與植物開花五大調(diào)控途徑中的光周期途徑。在擬南芥中，AtCDFs是開花抑制因子，該基因的表達受光周期的影響［2］。AtCDF1通過與開花誘導因子CO（CONSTANS）和成花基因FT（FLOWERING LOCUS T）啟動子中的特異位點結合，抑制CO和FT基因的轉錄，導致AtCDF1轉基因擬南芥開花延遲，然而在長日照條件下，泛素蛋白FKF1（F-BOX 1）與多跨膜結構蛋白GI（GIGANTEA）形成GI-FKF1（GIGANTEA-FLAVINBINDING，KELCH REPEAT，F(xiàn)-BOX1）蛋白復合體，抑制AtCDF1基因的轉錄，將AtCDF1從CO的啟動子區(qū)域解除下來，進而促進開花［2，89-91］。AtDof4.1作為一個轉錄抑制因子，延遲擬南芥開花，并且抑制生殖器官發(fā)育，葉片、花和角果變小［55］。在水稻中，OsDofs在抽穗期發(fā)揮調(diào)控作用，存在基因冗余現(xiàn)象［92］；OsDofs參與光周期響應，黑暗抑制OsDof12基因表達，光照誘導表達，在長日照（LDs）條件下，超表達OsDof12顯著降低轉基因水稻開花時間，下游基因Hd3a（Heading date3a）和OsMADS14（MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF14）上調(diào)表達，推測OsDof12基因通過直接或間接調(diào)節(jié)Hd3a和OsMADS14基因的表達，進而改變水稻開花時間［93］。干擾水稻晝夜波動OsRdd1（Rice Dof daily fluctuations 1）基因后，延長干擾植株的開花時間，并且水稻種子顆粒大小和千粒重均顯著減小［2，94］。超表達SlCDF3抑制轉基因擬南芥株系中CO和FT基因的表達，導致轉基因植株開花延遲［83］。CDF1-CDF3、CDF5基因的表達受光周期的調(diào)控，在光周期開始時表達量最高，處理16 h-20 h時轉錄水平降為最低值，在黎明時升高［95］。在麻風樹中，JcDof1和JcDof3基因在持續(xù)光照條件下，呈現(xiàn)出晝夜振蕩表達模式，并受藍光和紅光的影響，JcDof3可以與F-box發(fā)生體外蛋白互作，調(diào)節(jié)光周期開花［42，96］。在番茄中，SlCDFs基因也參與光周期響應，其中，SlCDF1和SlCDF3在光周期起始階段表達量最高，然而，SlCDF2、SlCDF4和SlCDF5在夜晚表達量達到峰值［83］。在多年生多次開花的楊樹中，PttCDFs基因與擬南芥的AtCDFs具有相似的晝夜振蕩表達模式，在光周期的起始階段表達量最高，由此說明，CDFs基因在擬南芥和楊樹中功能具有保守性［97］。在梨樹中，PbDof9.2基因的表達受光周期和生物鐘的調(diào)節(jié)，在擬南芥中異源表達PbDof9.2，通過促進PbTFL1a和PbTFL1b基因的轉錄，抑制開花時間調(diào)節(jié)因子FT的活性，延長轉基因植株的開花時間，表明Dof轉錄因子在植物光周期調(diào)控開花中具有功能保守性［36］。在苜蓿中，MtCDFd1_1呈現(xiàn)周期性的晝夜表達模式，在黎明時轉錄水平達到峰值，過表達MtCDFd1_1導致苜蓿在春化條件下開花延遲，在非春化條件下開花時間不受影響，MtCO-like基因的表達沒有變化；長日照誘導基因MtFTa1、MtFTb1、MtFTb2、和MtSOC1a下調(diào)表達［98］。Mtfta1和35S：MtCDFd1_1雙重突變體植株的開花時間不晚于Mtfta1，表明35S：MtCDFd1_1可能通過抑制MtFTa1的表達，進而影響春化條件下的開花，MtCDFs在苜蓿光周期下通過冗余的抑制FT-like基因（尤其是MtFTa1）的表達發(fā)揮作用，但是以CO獨立的光周期調(diào)控方式這與擬南芥中不同［98］。

4 Dof轉錄因子在毛竹中的研究進展

毛竹為禾本科竹亞科剛竹屬散生竹，是竹類植物中分布面積最大，用處最廣，集經(jīng)濟、生態(tài)、社會效益于一體的筍材兩用竹種。Dof轉錄因子在毛竹的非生物脅迫以及開花調(diào)控中也發(fā)揮重要作用。研究表明，大部分PheDofs參與毛竹干旱、低溫和高鹽的響應［99］，在4℃低溫和250 mmol/L NaCl處理的幼莖中，PheDof4-1誘導表達，而在20% PEG8000的根中轉錄水平顯著下降［39］；GUS染色結果表明，PheDof12-1主要在轉基因擬南芥的根、下胚軸、葉片維管束、雄蕊和花瓣中表達［100］。表達模式結果顯示，PheDofs在毛竹早期花序和盛花期中表達量較高［101］，不同花發(fā)育時期轉錄組測序結果顯示，有238個基因與毛竹開花相關，PheDofs基因在毛竹開花過程中成倍上調(diào)表達，在毛竹花發(fā)育的早期階段高量表達［102］，干旱誘導PheDofs上調(diào)表達，促進Hd3a和MADS14基因轉錄，進而促進毛竹開花［103］，推測Dof-Hd3a-MADS14調(diào)控通路在毛竹開花途徑中發(fā)揮關鍵作用［104］。原位雜交實驗結果顯示，PheDof1在毛竹的頂端分生組織、花序軸、穎片和苞片中表達；免疫印跡試驗表明，PheDof1主要在毛竹花發(fā)育的花芽形成期、花序伸長期和盛花期中表達，這表明PheDof1參與毛竹開花［105-106］。在擬南芥中超表達PheDof12-1，導致轉基因植株開花提前，開花誘導因子FT、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）、AGL24

（AGAMOUS-LIKE24）上調(diào)表達，開花抑制SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）、FLC（FLOWERING LOCUS C）下調(diào)表達；PheDofs是節(jié)律基因，參與光周期響應，在光周期處理條件下，大部分PheDofs基因在光照的起始階段表達量較高，在黃昏時分表達量較低，酵母單雜交結果顯示，PheDof12-1可以與PheCOL4的啟動子結合［100］。由此表明，PheDofs基因具有功能多樣性和保守性，不僅參與非生物脅迫響應，還參與光周期調(diào)控毛竹開花。

5 展望

Dof轉錄因子廣泛參與植物的種子萌發(fā)、碳氮代謝、非生物脅迫、開花調(diào)控等過程，表明了Dof轉錄因子在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，Dof轉錄因子的研究主要集中在模式植物和一年生植物中［43］，如擬南芥、水稻、番茄、大豆和玉米等。但是在多年生一次開花的毛竹中的研究少之甚少。該研究領域主要集中在毛竹筍的快速生長及激素調(diào)節(jié)等方面，在開花調(diào)控過程中，僅MADS-box、SOC1和FT基因有少量報道，其他轉錄因子相關報道幾乎為零，并且PheDofs轉錄因子的靶基因尚不明確，與其他轉錄因子或蛋白的相互作用共同調(diào)控毛竹開花的分子機制尚不清楚，是否像其他模式植物一樣通過Dof-CO-FT通路調(diào)節(jié)毛竹開花，還需要進一步研究。因此，在今后的研究中可以利用生物信息學、分子生物學和遺傳學方法，探索Dof轉錄因子調(diào)控毛竹開花的下游靶基因及其互作蛋白，這將有助于探索毛竹開花的分子機制，為研究其調(diào)控網(wǎng)絡提供新的思路和方法。