汪金秀 張琪 丁偉 陳拓

（1. 中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院，蘭州 730000；2. 復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200030）

抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重，天然產(chǎn)物作為抗生素的主要來源，根據(jù)其生物合成途徑的不同，可以分為聚酮、聚肽、萜類和生物堿等，其中聚肽類可分為非核糖體肽化合物（Non-Ribosomal Peptides，NRPs）和核糖體肽化合物（Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides，RiPPs）兩大類［1］，RiPPs 類天然產(chǎn)物因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性在抗生素開發(fā)方面受到廣泛的關(guān)注［2-3］。

RiPPs是以核糖體翻譯合成的前體肽（Precursor peptide，一般由20-110氨基酸組成）為基礎(chǔ)，經(jīng)過一系列后修飾酶的化學(xué)修飾，最終生成的具有一定生物活性的多肽類天然產(chǎn)物。其生物合成邏輯具有共同的特征，即都來自于前體肽，前體肽由結(jié)構(gòu)基因翻譯出的N端前導(dǎo)肽（Leader peptide）和C端的核心肽（Core peptide，某些C端含有識別序列Recongnition sequence），具有潛在活性的核心肽被催化生成具有成熟活性的肽類天然產(chǎn)物，前導(dǎo)肽和識別序列最終被移除（圖1）。核糖體肽復(fù)雜多樣的翻譯后修飾使其呈現(xiàn)出廣泛的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性多樣性（圖2）。

1 RiPPs分類及作用機(jī)制

細(xì)菌、真菌、植物及動物都可產(chǎn)生核糖體肽化合物［4］，其中，產(chǎn)生RiPPs最多的為細(xì)菌中的厚壁菌門［5］。目前，已知RiPPs有500余種，根據(jù)翻譯后修飾特征及其形態(tài)特征，將其分為18類［6］（圖3）。RiPPs不僅種類眾多，生物活性更是多種多樣。因發(fā)現(xiàn)較早，種類較多，羊毛硫肽是RiPPs中的“明星”家族，其代表分子Nisin長期用于食品保鮮劑［7］，但這些并不能掩蓋其余RiPPs的光芒，如真菌來源的核糖體肽 Phomopsin A具有良好的抗腫瘤活性，Siamycin具有抗HIV活性［8］，Microcin具有抗革蘭氏陰性菌活性［9］，Capistruin是RNA酶抑制劑［10］等。

圖1 RiPPs類天然產(chǎn)物生物合成邏輯

圖2 三種形態(tài)特征各異具有抗生素活性的核糖體肽類天然產(chǎn)物

圖3 RiPPs種類

RiPPs類天然產(chǎn)物復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其抗菌機(jī)制呈現(xiàn)多元化及多重化，現(xiàn)有研究表明RiPPs可以作用于細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、DNA、RNA或酶等［11］，如Salivaricin A2通過形成A環(huán)與細(xì)菌細(xì)胞 壁 的 脂 質(zhì)II結(jié) 合［12］，Polytheonamides的β螺 旋二級結(jié)構(gòu)及N-?；o助單元可以使細(xì)胞膜形成孔道［12-13］，Microcin J25是RNA聚合酶抑制劑等。有些RiPPs還具有多重抗菌機(jī)制［14］，既可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，又可以使細(xì)胞膜穿孔，如Nisin［15］（圖4）。

2 翻譯后修飾

圖4 Nisin作用機(jī)制及與lipid II作用圖

復(fù)雜多樣的翻譯后修飾在RiPPs化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性中起著極其重要的作用［16］。這一重要過程的“主角”是前體肽（Precursor peptide）和修飾酶（Tailoring enzymes），前體肽由N端的前導(dǎo)肽（Leader peptide）和C端核心肽（core peptide）組成，核心肽被后修飾酶如脫水酶、氧化還原酶或環(huán)化酶等催化修飾，前導(dǎo)肽隨后被一系列轉(zhuǎn)運(yùn)體、肽酶或兩者的結(jié)合體移除，最終成為具有生物活性的成熟的核糖體肽類天然產(chǎn)物［16］（圖5）。前導(dǎo)肽雖然最終被切掉了，但是在翻譯后過程中，它是修飾酶、免疫以及輸出過程必不可少的識別“卡片”。雖然生物合成酶識別前體肽的具體細(xì)節(jié)尚不清楚，但是研究表明大多數(shù)前導(dǎo)肽在溶液中或與生物合成蛋白結(jié)合時都傾向于形成α螺旋。前導(dǎo)肽和核心肽的長度在不同系統(tǒng)中差異很大，值得注意的是，其長度與成熟肽的長度并無相關(guān)性。前體肽通過翻譯后修飾最終成為成熟的肽，修飾主要有脫水、環(huán)化和重排。此外，還可以形成二硫鍵和雜環(huán)，大環(huán)化和核苷酸化等［14］；根據(jù)修飾發(fā)生的位置，可以分為主鏈修飾和側(cè)鏈修飾［17］。酶在各類翻譯后修飾過程中具有舉足輕重的作用［18］。

圖5 RiPPs翻譯后修飾過程［16］

2.1 側(cè)鏈修飾

2.1.1 絲氨酸和蘇氨酸脫水（Dehydratase） 絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）脫水是側(cè)鏈常見修飾，含羥基的氨基酸Ser和Thr在脫水酶（Dehydratase）的作用下分別生成2，3-雙脫氫丙氨酸（Dha）和（Z）-2，3-雙脫氫丁氨酸（Dhb）［19］，絲氨酸和蘇氨酸脫水形成的雙鍵進(jìn)而可以和分子內(nèi)的巰基或胺基發(fā)生加成反應(yīng)，生成醚或亞胺，這種分子內(nèi)的親電加成反應(yīng)可以生成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的RiPPs的中特征結(jié)構(gòu)單元，如羊毛硫肽（Lanthionine），含氨基乙烯基半胱氨酸殘基（AviCys）的多肽，含賴丙氨酸的多肽［20］（圖6）。

圖6 I型羊毛硫肽合成酶LanB催化絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）脫水［20］

2.1.2 半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸雜環(huán)化（Heterocyclization） 當(dāng)來源于Cys，Ser或Thr的側(cè)鏈硫醇或羥基親核進(jìn)攻相鄰氨基酸的羰基碳時，分別形成噻唑啉，惡唑啉或甲基惡唑啉［21-22］，而α-β連接部分的進(jìn)一步氧化，分別形成了噻唑環(huán)、噁唑環(huán)或甲基噁唑環(huán)（圖7）。雜環(huán)化在RiPPs中具有重要作用，首先，雜環(huán)結(jié)構(gòu)限制了肽骨架的構(gòu)象，使多肽結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。其次，雜環(huán)作為非常通用的藥效團(tuán)，與含雜環(huán)的天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或核酸之間存在多種相互作用［23］。另外，噻唑常出現(xiàn)在許多鐵載體中，這為某些含雜環(huán)的核糖體肽類物質(zhì)充當(dāng)金屬螯合劑提供了可能性［23］。噁唑啉和噻唑啉氧化成噁唑環(huán)和噻唑環(huán)，這進(jìn)一步限制了肽的構(gòu)象，并能夠顯著影響生物活性。將噁唑啉/噻唑啉氧化成噁唑/噻唑可顯著降低水解開環(huán)傾向［24］，這點(diǎn)是否具有生物相關(guān)性尚不清楚。最后，盡管Cys和Ser衍生的雜環(huán)是電子等排的，但已有論據(jù)證明噁唑啉/噁唑取代噻唑啉/噻唑之后會在極大程度上影響生物活性［25］。

圖7 來源于半胱氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的雜環(huán)［22］

2.1.3 異戊二烯化（Prenylation） RiPPs中，在核心分子中加入異戊二烯衍生的亞基是極為普遍的。在初級代謝中，異戊二烯衍生對正常的細(xì)胞功能也至關(guān)重要，如蛋白的法尼基化和四異戊二烯化作用［26］。目前文獻(xiàn)報道的異戊二烯化的RiPPs有2個家族，其一是從芽孢桿菌（Bacillus）分離的ComX信號肽家族。高度保守的Trp殘基進(jìn)行法尼基化（Farnesylated）或香葉基化（Geranylated），以生成異戊二烯化的肽。生物合成的異戊二烯化反應(yīng)在異戊二烯基焦磷酸的1位C和Trp的3位C之間形成C-C鍵，同時在Trp的N原子和Trp的2位C之間形成新鍵，在Trp殘基上形成第3個環(huán)［27］（圖8）。其二是來自藍(lán)細(xì)菌（Prochloronspp. cyanobacteria）的Cyanobactin peptides的修飾，有學(xué)者推測是通過由二甲基烯丙基焦磷酸化（DMAPP）得到，共價醚鍵由Ser/Thr羥基和DMAPP 3位C碳親核反應(yīng)形成［28］。來自藍(lán)細(xì)菌的其他烯丙基化小肽在DMAPP的1位C或3位C處被修飾。通常，RiPPs的異戊烯化會增強(qiáng)其親脂性［29］（圖8）。

圖8 Ser、Thr和Trp的烯丙基化后的結(jié)構(gòu)［26］

2.1.4 SAM自由基修飾 在RiPPs中，自由基S-腺苷甲硫氨酸（RadicalS-adenosylmethionine，rSAM）蛋白質(zhì)家族可以負(fù)責(zé)進(jìn)行一些十分困難的生物學(xué)轉(zhuǎn)化［30］。rSAM 中4Fe-4S簇通常與3個半胱氨酸殘基連接，而這3個半胱氨酸殘基通常是來源于易于識別的CxxxCxxC序列。Fe-S簇將電子轉(zhuǎn)移到SAM上，對SAM的不穩(wěn)定的S原子進(jìn)行還原裂解，從而得到甲硫氨酸和5'-脫氧腺苷（5'-Ado）自由基（圖9-A）［31］。該自由基被用于進(jìn)行各種具有挑戰(zhàn)性的合成反應(yīng)，如Sactipeptide中 硫 醚 鍵 的 形 成（圖9-B）［32-33］；隨著家族成員的增多，rSAM蛋白的功能不斷擴(kuò)展，如那西肽（Nosiheptide）含有的吲哚酸衍生物就是由兩種rSAM酶NosL和NosN催化的，NosL 負(fù)責(zé)L-色氨酸重排至3-甲基-2-吲哚酸（3-methyl-2-indolic acid，MIA）［34］（圖9-C）。其中，NosL是rSAM家族中第一個可以同時使底物發(fā)生裂解和重排的酶。

此外，rSAM依賴的自由基酶催化多樣性是RiPPs生物合成的一大研究方向和熱點(diǎn)。

2.2 主鏈修飾

2.2.1 蛋白水解（Proteolysis） 前體肽的蛋白水解是RiPPs生物合成中的主要特征，除Pyrroloquinoline quinone（PQQ）和Cyanobactins在N端和C端都發(fā)生水解之外，蛋白水解一般發(fā)生在肽N端，蛋白水解后RiPPs才具有活性［35］（圖2）。有些蛋白水解酶與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶連在一起，即可以進(jìn)行前體肽水解，同時也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)輸出，如II型羊毛硫肽中LanT，H?varstein等［36］認(rèn)為這與前體肽序列中的雙甘氨酸基序有關(guān)。每類RiPPs都有相同的前體肽保守序列作為前體肽水解酶的識別位點(diǎn)，I型羊毛硫肽前體肽保守序列位于位于-18和-15區(qū)，-1位的精氨酸和-4位的丙氨酸對于水解酶NisP的識別是必須的；II型羊毛硫肽和一些細(xì)菌素，識別位點(diǎn)為GG或GA［37］（圖10）。因此，僅使用生物信息學(xué)方法就可以準(zhǔn)確預(yù)測一些RiPPs最終產(chǎn)物的氨基酸組成。雖然前體肽最終被切除，但它在RiPPs的生物合成過程中具有重要意義，它不僅是修飾酶、免疫及輸出過程必不可少的識別“卡片”，還能起到保護(hù)宿主的作用［38］。

圖9 rSAM依賴的生物學(xué)轉(zhuǎn)化

2.2.2 大環(huán)化（Macrocyclization） 真核生物中，RiPPs一般是N-C末端大環(huán)化，而在細(xì)菌RiPPs中，除了N-C大環(huán)化形成酰胺鍵之外，一些親核側(cè)鏈殘基之間也可以形成酰胺鍵（圖11），細(xì)菌來源的N-C端大環(huán)化的RiPPs在大小上差異較大，如Cyanobactins僅由6-12個氨基酸組成［39］，Uberolysin和Butyrivibriocin AR10等可以多達(dá)70個氨基酸，Subtilosin A有35個氨基酸，且除了N-C端的大環(huán)外，還含有硫醚鍵形成的小環(huán)［40］。RiPPs環(huán)化可以賦予化合物結(jié)構(gòu)剛性以增加代謝穩(wěn)定性，修飾N和C末端以限制外切蛋白酶降解的敏感性。有學(xué)者認(rèn)為構(gòu)象剛性可以讓化合物更好的與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合，另外環(huán)化特征也可以賦予化合物藥理學(xué)特性［41］。

2.2.3 核苷酸化（Nucleotidylation） 核苷酸修飾在生物分子中十分常見，然而，在所有的細(xì)菌素中，僅Microcin C7（或被稱為Microcin C51320）是被核苷酸化修飾過的［42］（圖12）。這種修飾有趣之處在于通過形成氮磷磷酰胺鍵來實(shí)現(xiàn)核苷酸修飾。修飾后的Microcin C7是腺苷化的天冬氨酸Asp的結(jié)構(gòu)類似物，而這個中間體可使得天冬酰胺-tRNA帶上電荷。

圖10 I型和II型羊毛硫肽和非羊毛硫肽細(xì)菌素的序列比對圖［37］

圖11 幾種環(huán)化RiPPs［6］

圖12 Microcin C7核苷酸化修飾［42］

2.2.4 形成內(nèi)酯（Lactone formation） 細(xì)菌的RiPPs中，僅在革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生的Quorum sensing peptides中發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯，特別是產(chǎn)自葡萄球菌（Staphylococcus）的多種自誘導(dǎo)肽（Auto-inducing peptide，AIP）衍生物，這類自誘導(dǎo)肽衍生物含有5-9個氨基酸，結(jié)構(gòu)中含有多個硫代內(nèi)酯環(huán)［43］。一般是C末端的5個Cys殘基上的巰基SH進(jìn)攻末端羧基形成硫代內(nèi)酯。而僅有兩個特例，當(dāng)5個Cys殘基突變?yōu)镾er殘基后，形成的是內(nèi)酯而非硫代內(nèi)酯。這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)對于生物活性至關(guān)重要，某些細(xì)菌菌株會產(chǎn)生內(nèi)酯酶，可以破壞Quorum sensing peptides［44］。

2.2.5 吡咯并喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）修飾 PQQ是細(xì)菌代謝中的氧化還原輔因子，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征［45］。前體肽PqqA的長度為23-39個氨基酸，其具體長度取決于細(xì)菌種族。在前體肽PqqA中發(fā)現(xiàn)的是序列：Glu-Val-Thr-Leu-Tyr，與Cyanobactins一樣，其C端和N端均會從前體肽中切除。在加工過程中，將Glu和Tyr連接在肽上，并切除所有其他氨基酸。在生物合成過程中形成1個C-C鍵和2個N-C鍵，通過幾次氧化反應(yīng)縮合生成PQQ雜環(huán)［46］（圖13）。

圖13 PQQ的形成過程［46］

正是這些種類繁多的后修飾反應(yīng)，才造就了核糖體肽類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性。RiPPs生物合成酶的不斷出現(xiàn)，極大拓展了我們對自然界有機(jī)反應(yīng)及酶的進(jìn)化適應(yīng)性的認(rèn)識。但是自然界還有大量RiPPs修飾酶未被表征，相應(yīng)地，許多翻譯后修飾的生物合成過程也依舊未揭開其神秘的面紗，這將是未來RiPPs研究的焦點(diǎn)和趨勢所在。

3 基因挖掘與發(fā)現(xiàn)新的RiPPs

生物信息學(xué)的發(fā)展極大推動了RiPPs研究，利用編碼前體肽或生物合成蛋白的基因之間的序列相似性，在DNA和蛋白序列數(shù)據(jù)的數(shù)量不斷增加，以及有關(guān)RiPPs生物合成途徑的不斷更新的背景下通過生物信息技術(shù)與合成生物學(xué)相結(jié)合的方法，因此得以發(fā)現(xiàn)許多新的RiPPs［47-48］，RiPPs基因組挖掘策略如圖14。目前，RiPPs基因組挖掘所用的工具通常有BLAST、BAGEL、antiSMASH、ClusterFinder和RiPP-PRISM等。Emmanuel開發(fā)的NeuRiPP系統(tǒng)利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Deep neural network，DNN）模型可以在一定程度上預(yù)測新前體肽序列［49］，但是前體肽的識別仍然是一項(xiàng)需要繼續(xù)完善的工作。有研究者分析了65 421個原核生物的基因組發(fā)現(xiàn)，編碼RiPPs的原核生物多達(dá)20%，編碼RiPPs基因組多達(dá)近2 000個［50］，而目前已知的RiPPs不過500余種，RiPPs具有極大的開發(fā)潛能。

通過比對各種數(shù)據(jù)庫，一方面，可以根據(jù)前體肽（Precursor peptide）中保守的前導(dǎo)肽（Leader peptide）序列找到同一家族未被挖掘的RiPPs；另一方面，生物信息學(xué)揭示了許多生物合成途徑可以利用同樣的酶進(jìn)行某一翻譯后修飾過程，可以通過序列相似性網(wǎng)絡(luò)圖清楚了解目標(biāo)酶所屬的類群，從而更好更有目的性的去研究其結(jié)構(gòu)和功能，如參與羊毛硫肽（Lanthepteptides）生物合成的Ser/Thr脫水酶也在硫肽和一些線性含唑肽（leucine aminopeptiolase，LAP）的生物合成途徑中發(fā)揮作用［51-53］；而某些參與硫肽中噁唑和噻唑形成的酶也在LAP、肉毒桿菌素和藍(lán)藻素的生物合成基因簇中發(fā)現(xiàn)；編碼SAM自由基酶的基因也出現(xiàn)在硫肽和肉毒桿菌素（Bottromycins）的生物合成基因簇中［54-55］。由此可見，翻譯后修飾酶基因的水平轉(zhuǎn)移極大推動了化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)化?；蚪M挖掘?yàn)榘l(fā)現(xiàn)更多的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性新穎的RiPPs提供了加速器。

圖14 RiPPs基因組挖掘策略流程圖

4 總結(jié)與展望

來源于細(xì)菌、真菌、植物及動物的各類RiPPs，擴(kuò)充了化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性。相較NRPs必須通過非核糖體肽合成酶功能改造才能獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的類似物，RiPPs的優(yōu)勢在于可僅從基因水平上改變幾個密碼子來改變化合物的骨架結(jié)構(gòu)，通過組合生物等改造手段獲得多種具有生物活性的衍生物，其生物改造簡單易行，這在新化合物合成和發(fā)現(xiàn)方面獨(dú)具優(yōu)勢，尤其在細(xì)菌耐藥性日益增強(qiáng)而新抗生素日漸式微的當(dāng)下，RiPPs對于開發(fā)新藥意義重大。RiPPs種類繁多的翻譯后修飾過程研究不僅具有重要的理論價值，同時為代謝工程和合成生物學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)的不斷前進(jìn)，勢必會加速新RiPPs的挖掘，通過在各類數(shù)據(jù)庫中比對保守的前導(dǎo)肽序列，找到同一家族未被挖掘的RiPPs，通過修飾酶序列相似性網(wǎng)絡(luò)圖清楚了解目標(biāo)酶所屬的類群，從而更有目的性的去研究其結(jié)構(gòu)和功能，再結(jié)合合成生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物化學(xué)等方法，完成從基因序列到活性化合物的研究過程，從而挖掘出更多結(jié)構(gòu)和功能新穎的化合物。

此外，各類生物技術(shù)，如基因編輯技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和細(xì)胞工程等的不斷進(jìn)化和發(fā)展也是新RiPPs挖掘的加速器，相信隨著這些技術(shù)的不斷完善和進(jìn)化，未來將有更多功能和結(jié)構(gòu)新穎的RiPPs與我們見面。