王丹蕊 沈文麗 魏子艷 王尚 鄧曄，，3

（1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；2. 山東大學(xué)海洋研究院，青島 266237；3. 中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

單細(xì)胞測序技術(shù)是指在單細(xì)胞水平上，通過全基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，對核酸分子進(jìn)行高通量測序的技術(shù)。該技術(shù)能夠揭示單個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，剖析單個細(xì)胞對生態(tài)系統(tǒng)或有機(jī)體的貢獻(xiàn)［1-2］。1990 年，Iscove等［3］首次提出對單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的構(gòu)想，并用 PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對 cDNA 分子的指數(shù)級擴(kuò)增。1992年，Telenius等［4］開發(fā)出寡核苷酸引物PCR（Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOPPCR）的方法，用簡并寡核苷酸序列擴(kuò)增基因組，為單細(xì)胞測序提供了思路。直到2001年，Dean等［5］首次使用隨機(jī)六聚體引物和φ29 DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了DNA的滾環(huán)擴(kuò)增，隨后Raghunathan和Lasken等［6-7］于2005年發(fā)明了多重置換擴(kuò)增技術(shù)（Multiple displacement amplification，MDA），實(shí)現(xiàn)了對單細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增與測序。但此時的單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)在覆蓋度和擴(kuò)增偏好性方面有明顯的局限性，隨后一些研究者致力于克服這些問題。例如，Stepanauskas等［8］于2017年 使 用φ29 DNA聚合酶的熱穩(wěn)定突變體提高了單細(xì)胞基因組測序的覆蓋度；哈佛大學(xué)謝曉亮團(tuán)隊(duì)［9］于2012年發(fā)明了多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC），通 過擬線性的擴(kuò)增過程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。發(fā)展至今，單細(xì)胞測序技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)、微生物學(xué)、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和免疫學(xué)研究中取得了廣泛應(yīng)用，臨床上也已用于輔助生殖和腫瘤的診斷與治療［10］。Nature Methods于2011年將單細(xì)胞研究方法列入最值得關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域，又于2013 年將相關(guān)應(yīng)用列為年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展；近日Nature再次將單細(xì)胞測序技術(shù)評為2020年度最受期待的技術(shù)之一。

相比擴(kuò)增子測序和宏基因組測序，單細(xì)胞擴(kuò)增和測序技術(shù)有其獨(dú)特的不可替代的優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增子測序是指對微生物的特定基因進(jìn)行測序［11］，傳統(tǒng)針對16S rDNA、18S rDNA或ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）基因進(jìn)行的擴(kuò)增子測序雖然可以滿足檢測微生物群落多樣性的需求，但這種方法很難準(zhǔn)確鑒定到屬以下的分類等級，也無法深入探究物種的功能信息［12］。宏基因組測序又稱環(huán)境基因組測序或群落基因組測序，直接對樣本中所有微生物的全基因組進(jìn)行測序，可以同時對物種和功能基因做出鑒定，也有助于發(fā)掘潛在代謝途徑。然而該方法容易忽視某些稀有種［13］，且測序結(jié)果的組裝也始終是一大難題［14-15］。如果說宏基因組數(shù)據(jù)集是捕獲整個群落信息的一張巨網(wǎng)［16］，那么單細(xì)胞測序方法則是分離目標(biāo)基因組的“手術(shù)刀”和深入探究目標(biāo)群落的“放大鏡”，能不斷細(xì)化、深化我們對微生物群落的認(rèn)識［17］。

本綜述重點(diǎn)介紹了在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域使用過或具有應(yīng)用前景的單細(xì)胞分離技術(shù)和單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，并詳細(xì)論述了單細(xì)胞測序技術(shù)在獲得單細(xì)胞基因組、剖析種群異質(zhì)性、探究種間關(guān)系、聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育和功能信息等方面的應(yīng)用，最后在此基礎(chǔ)上對其在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出了一些展望。

1 單細(xì)胞分離與全基因組擴(kuò)增

通常單細(xì)胞測序的完整流程包括樣品保存與制備、單細(xì)胞分離、細(xì)胞裂解、全基因組擴(kuò)增（WGA）與產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育篩選、文庫制備與測序、測序結(jié)果的質(zhì)量控制［18］，其中單細(xì)胞分離與全基因組擴(kuò)增是最為關(guān)鍵的步驟，諸多技術(shù)已被開發(fā)并應(yīng)用于微生物的相關(guān)領(lǐng)域，而如何根據(jù)科學(xué)問題對分離和擴(kuò)增的方法進(jìn)行選擇或改進(jìn)對科學(xué)研究具有重大意義。

1.1 細(xì)胞分離技術(shù)

細(xì)胞分離是單細(xì)胞測序的第一步，其準(zhǔn)確性將直接影響后續(xù)的測序和分析。提高通量、減少樣品與試劑的消耗、提高細(xì)胞分離捕獲的靈敏度和精確性一直是研究者的目標(biāo)。常用的細(xì)胞分離技術(shù)包括有限稀釋法（Limited dilution）、顯微操作法（Micromanipulation）、激光捕獲顯微分離技 術(shù)（Laser capture microdissection）、拉 曼 鑷 子（Raman tweezers）、渦旋與相分隔（Vortex and phaseseparation）、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（Fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS）和微流控技術(shù)（Microfluidics）［19-21］（表1）。其中微流控技術(shù)因其較低的成本、較高的通量和理想的分離效果在近10年發(fā)展迅速，成為細(xì)胞分離技術(shù)的主流方向［22］。

1.2 單細(xì)胞基因擴(kuò)增技術(shù)

單細(xì)胞分離之后需要通過單細(xì)胞基因擴(kuò)增技術(shù)使單個細(xì)胞內(nèi)極微量的DNA放大至納克或微克水平，同時也將較長的DNA片段化，滿足下一步測序的需要。目前常用的方法包括簡并寡核苷酸引物PCR、多重置換擴(kuò)增技術(shù)、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、Tn5轉(zhuǎn)座酶技術(shù)［28］，以及新興的細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù)（Emulsion，paired isolation and concatenation PCR，epicPCR）［20］。

簡并寡核苷酸引物PCR（圖1-A）使用隨機(jī)簡并引物對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增。由于隨機(jī)引物退火溫度的不均一性，不同序列擴(kuò)增效率的差異被PCR反應(yīng)成倍放大，產(chǎn)生大量擴(kuò)增不足的區(qū)域，導(dǎo)致基因 組 覆 蓋 率 較 低［4］。2017年，Blagodatskikh等［29］改進(jìn)了該技術(shù)并命名為iDOP-PCR（Improved DOPPCR），新的方案使用具有熱穩(wěn)定性的聚合酶，并調(diào)整了引物設(shè)計(jì)，可顯著提高文庫質(zhì)量。

表1 常見單細(xì)胞分離技術(shù)一覽

圖1 常見單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)原理示意圖

多重置換擴(kuò)增技術(shù)（圖1-B）是目前環(huán)境微生物領(lǐng)域最為成熟也是應(yīng)用最廣的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)。由于φ29 DNA聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性和校正活性，因此與DOP-PCR相比，多重置換擴(kuò)增技術(shù)（Multiple displacement amplification，MDA）具有更高的序列覆蓋度和保真度［30］，但也存在外源DNA污染、序列覆蓋不均、嵌合體干擾、序列組裝與分析困難等不足［31］。由于MDA的偏差在一定程度上是隨機(jī)的，所以通?？梢酝ㄟ^多個數(shù)據(jù)集的混合拼接來減小這種偏差同時提高組裝的完整性［32］。研究表明，2-5個單細(xì)胞擴(kuò)增基因組數(shù)據(jù)集混合組裝得到的基因組完整性中位數(shù)>97%，高于單個單細(xì)胞組裝完整性的中位數(shù)（30%-90%）［33］。隨后Povilaitis等［34］基于多重置換擴(kuò)增的原理改進(jìn)得到全基因組擴(kuò)增技術(shù)WGA-X，使用耐熱的突變體φ29DNA聚合酶將延伸溫度從30℃提高到45℃，大大提高了從CG含量高的單個環(huán)境細(xì)胞或病毒體回收基因組的能力。

多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）（圖1-C）通過準(zhǔn)線性預(yù)放大來減少與非線性放大相關(guān)的偏差。該技術(shù)利用特殊引物，使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán)，從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增［9］。MALBAC所使用的引物3'端是8個隨機(jī)的核苷酸序列，5'端是27個固定的核苷酸序列，最大的特點(diǎn)在于它是準(zhǔn)線性擴(kuò)增而非指數(shù)擴(kuò)增，因此拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV）檢測的準(zhǔn)確性高且單核苷酸變異（Single nucleotide variants，SNV）檢測的假陰性率低；而且，MALBAC的偏差具有可重復(fù)性，因此可進(jìn)行降噪和歸一化處理。然而，由于該技術(shù)使用的DNA聚合酶保真度低于φ29 DNA聚合酶，SNV檢測的假陽性率高于MDA。目前MALBAC主要用于醫(yī)療診斷［35］，在微生物單細(xì)胞的準(zhǔn)確組裝方面相比MDA優(yōu)勢不明顯，在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景不及MDA［36］。

Tn5轉(zhuǎn)座酶（圖1-D）最初用于二代測序的文庫構(gòu)建，將DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接等簡化為一步，大大簡化建庫步驟的同時為單細(xì)胞測序提供了有力工具?；赥n5轉(zhuǎn)座酶，謝曉亮團(tuán)隊(duì)［37］于2017年提出了改良的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法（Linear amplification via transposon insertion，LIANTI），用Tn5轉(zhuǎn)座子結(jié)合T7啟動子形成的轉(zhuǎn)座復(fù)合體隨機(jī)插入單細(xì)胞基因組DNA，將基因組片段化并與T7啟動子連接。隨后T7啟動子行使體外轉(zhuǎn)錄功能，用轉(zhuǎn)錄獲得大量線性擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄本，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行建庫測序。該過程進(jìn)行的是線性擴(kuò)增，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的穩(wěn)定性，使LIANTI在遺傳疾病的檢測方面更加有效和精確。同年，Lan等［21］利用微流控技術(shù)將單細(xì)胞測序技術(shù)的通量提高到50 000個細(xì)胞/次，使得轉(zhuǎn)座酶適用于環(huán)境基因組研究。

細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù)（圖1-E）是單細(xì)胞分離技術(shù)、融合PCR、巢式PCR和測序技術(shù)的結(jié)合，廣義而言也可歸于單細(xì)胞測序的范疇。首先，通過稀釋和渦旋將樣品分散成單細(xì)胞體系；然后對待研究的系統(tǒng)發(fā)育基因和功能基因進(jìn)行融合擴(kuò)增；隨后進(jìn)行巢式PCR，建庫并進(jìn)行二代測序［20］。該技術(shù)的成本遠(yuǎn)低于普通單細(xì)胞全基因組測序，單次實(shí)驗(yàn)的通量可高達(dá)107個細(xì)胞，在解決物種與功能、種間關(guān)系等科學(xué)問題方面有良好的應(yīng)用前景［38］。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)在微生態(tài)研究中的應(yīng)用

目前，關(guān)于微生物生態(tài)的研究大多是群體水平，比如基于宏基因組學(xué)的研究能夠獲得群體的遺傳潛力，盡管信息量很大，但無法探究個體的遺傳潛力，細(xì)胞間的關(guān)聯(lián)和異質(zhì)性等問題也沒有得到很好的解決［39］。單細(xì)胞測序與單細(xì)胞組學(xué)等新技術(shù)、新方法的出現(xiàn)為探索復(fù)雜環(huán)境中的單細(xì)胞生態(tài)學(xué)提供了嶄新的機(jī)會［40］。單細(xì)胞基因組學(xué)的組裝過程不依賴宏基因組數(shù)據(jù)的組裝和分箱算法，因此能夠較為準(zhǔn)確地獲得單個細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒、病毒等遺傳信息［41］，深入發(fā)掘不可培養(yǎng)的未知微生物的功能［42］；該方法在個體細(xì)胞尺度上對樣本進(jìn)行研究［43］，從而為探究種群異質(zhì)性提供了有效手段。此外，單細(xì)胞基因組學(xué)也常用于研究基因之間的相互作用，破譯微生物間或微生物與宿主的交流行為［44］，揭示各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能等［45］。

2.1 獲得單細(xì)胞基因組

地球有豐富的微生物資源。根據(jù)比例法則結(jié)合生物多樣性的對數(shù)正態(tài)模型進(jìn)行的預(yù)測估計(jì)，全球微生物物種可能高達(dá)1012種［46］。其中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)或還未被充分認(rèn)識的，所以由于其未知性也被稱作生態(tài)系統(tǒng)的暗物質(zhì)［47］。無需培養(yǎng)的微生物分析鑒定方法（如宏基因組測序），自2004年出現(xiàn)以來一直廣受歡迎［48］。然而，環(huán)境中微生物通常由個別豐度高的物種和大量豐度低的物種組成［49］，由于采樣方法、測序深度等限制，大多數(shù)研究都是針對豐度較高的種群開展的。Schlos等［50］對近11.3萬個細(xì)菌和古菌OTU進(jìn)行普查后發(fā)現(xiàn)環(huán)境中存在大量的稀有物種，且基于傳統(tǒng)方法得到的信息非常有限。單細(xì)胞測序技術(shù)為獲取稀有物種的基因組、發(fā)現(xiàn)新的代謝通路提供了支持［32］。

單細(xì)胞測序技術(shù)對細(xì)菌和古菌的暗物質(zhì)基因組百科（GEBA-MDM）項(xiàng)目有很大貢獻(xiàn)，推動了微生物的功能預(yù)測和系統(tǒng)發(fā)育鑒定［51］，極大拓展了系統(tǒng)發(fā)育樹上的微生物多樣性［52］。2017年，Yu 等［53］基于微流控技術(shù)開發(fā)出一種具有單細(xì)胞分辨率的微型宏基因組方法，并用它分析了黃石國家公園的兩個溫泉樣本，從中獲得了29個新的基因組草圖。Sieracki等［54］用單細(xì)胞基因組學(xué)方法研究了一系列海洋樣品中小型原生生物的多樣性，揭示了生態(tài)系統(tǒng)中新的相互作用和代謝途徑。Ahrendt等［55］使用單細(xì)胞基因組學(xué)方法對8種不可培養(yǎng)真菌的基因組進(jìn)行了測序，結(jié)果表明，通過結(jié)合多個擴(kuò)增基因組，可以獲得90%以上的單細(xì)胞基因組。

2.2 剖析種群異質(zhì)性

常用于物種鑒定的系統(tǒng)發(fā)育基因是高度保守的，僅可在屬水平上作為物種鑒定的參考，不能反映生態(tài)系統(tǒng)中單細(xì)胞物種基因組的多樣性［56］；宏基因組測序中，應(yīng)用最普遍的二代測序都基于短片段序列，通常會破壞種內(nèi)變異，經(jīng)拼接得到的也都是忽略個體差異的泛基因組［57］；三代測序可讀取較長片段，但目前準(zhǔn)確性和通量都比較低［58-59］。相較之下，單細(xì)胞測序可以通過捕捉細(xì)胞間的基因組變異來剖析自然環(huán)境中的種群異質(zhì)性。因此，它可以闡明微生物多樣性和生態(tài)位劃分，也能夠用于基因水平轉(zhuǎn)移的研究［32］。

Kashtan等［60］利用從1 000個原氯球菌細(xì)胞產(chǎn)生的大型單細(xì)胞擴(kuò)增基因組文庫來確定同一物種的不同生態(tài)型在整個季節(jié)變化中的基因組變異。測序結(jié)果顯示，該種群由數(shù)百個具有不同“基因組骨架”（Genomic backbones）的亞種群組成，每個骨架包括一組不同的關(guān)鍵等位基因和一些特有的可變基因。Yoon等［61］對3個海洋原生生物（皮膽蟲）進(jìn)行單細(xì)胞鳥槍法測序，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞代表了3種不同的微生態(tài)系，也為紅藻亞界存在異養(yǎng)門提供了證據(jù)。Engel等［62］成功地應(yīng)用單細(xì)胞基因組學(xué)評估了蜜蜂腸道微生物群中兩個共生菌在物種水平上的異質(zhì)性，揭示了菌株和生態(tài)位在代謝方面的特異性。2018年，Jochum等［63］對來自奧胡斯灣沉積物中的7個單細(xì)胞基因組進(jìn)行了測序和分析，以了解它們在芳香化合物降解和能量代謝方面的潛力。研究證實(shí)了該種群具有代謝多樣性，反映出微生物應(yīng)對不同的能量條件和硫酸鹽限制的生存策略。微生物所表現(xiàn)的這種種群異質(zhì)性是一種適應(yīng)性特征，可以提高微生物對多變或非均質(zhì)環(huán)境條件的適應(yīng)能力［64］。

2.3 探究種間關(guān)系

對微生物而言，每個細(xì)胞都是一個完整的遺傳個體，包含了自身染色體、質(zhì)粒、細(xì)胞器、病毒和其他內(nèi)共生體的全部遺傳信息。單細(xì)胞基因組學(xué)可以無差別地獲得細(xì)胞內(nèi)包含的所有遺傳物質(zhì)，從而在染色體DNA和其他遺傳信息之間建立聯(lián)系［65］。近五年的研究表明噬菌體與30多種細(xì)菌或古菌有關(guān)［66］；還發(fā)現(xiàn)了一些能感染真核細(xì)胞的巨病毒［67］。2011年，Yoon等［61］在從海洋中分離出的單細(xì)胞中檢測到了內(nèi)生菌和病毒的遺傳信息，揭示了單個細(xì)胞間的相互作用；于2014年，Roux等［68］結(jié)合單細(xì)胞測序和宏基因組測序取得了127個不可培養(yǎng)細(xì)菌的單細(xì)胞擴(kuò)增基因組發(fā)現(xiàn)，SUP05病毒會使其宿主的能量代謝重構(gòu)；2019年，Martinez-Hernandez等［69］發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)洋桿菌是海洋中數(shù)量極其豐富但未經(jīng)培養(yǎng)的37-F6病毒的宿主；Labonte等［70］使用單細(xì)胞基因組學(xué)研究了擴(kuò)散流、低溫?zé)嵋簢娍谥惺删w與宿主的相互作用，結(jié)果表明，噬菌體感染后發(fā)生溶原化但不裂解宿主，與宿主共進(jìn)化且增強(qiáng)了宿主對有毒金屬和抗生素的抗性。

除此之外，單細(xì)胞測序也可用于探究細(xì)胞間的相互作用，發(fā)現(xiàn)微生物間的共生體，例如Nanoarchaeota和Ignicoccus的 共 生 關(guān) 系［71］、Actinomyces odontolyticus和Candidatus Saccharibacteria的寄生關(guān)系等［72］。低溫透射電鏡顯示，酸性礦山廢水中古菌之間常常存在物理性的胞間連接，例如細(xì)胞質(zhì)橋、菌毛等［73］。如果胞間的相互作用足夠強(qiáng)，不會在細(xì)胞分離過程中被破壞，單細(xì)胞測序技術(shù)則可將兩個或多個細(xì)胞視作一個整體進(jìn)行測序。Munson-McGee等［41］結(jié)合單細(xì)胞基因組測序和宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，高溫酸性溫泉中專性共生納米古菌與宿主的物理關(guān)聯(lián)。2019年，Nakayama等［74］為了深入了解海洋藍(lán)藻共生，對宿主遠(yuǎn)洋鞭毛藻進(jìn)行單細(xì)胞測序并分析其中的藍(lán)藻基因組。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，樣本中藍(lán)藻屬于新的分支，它與宿主鞭毛藻嚴(yán)格共存且經(jīng)歷了獨(dú)立的進(jìn)化，這種密切的共生關(guān)系導(dǎo)致它無法被傳統(tǒng)宏基因組學(xué)檢測到。因此，單細(xì)胞測序?qū)Πl(fā)掘物種的多樣性、生活方式、代謝途徑和進(jìn)化過程具有重大意義。

隨著細(xì)胞內(nèi)融合技術(shù)的發(fā)展成熟，2019年，F(xiàn)lorenza等［38］建議使用epicPCR探究環(huán)境中真核生物和原核生物的相互作用關(guān)系，如固氮菌和浮游生物之間的互利共生［75］，藻細(xì)胞周圍的微型“生物圈”中有以碳水化合物為食的異養(yǎng)細(xì)菌［76］，還有病原菌感染細(xì)胞并在宿主細(xì)胞中增殖［77］。該方法將單個真核細(xì)胞和伴生的原核細(xì)胞形成的單個細(xì)胞簇分散到液滴中，既實(shí)現(xiàn)了單個真核細(xì)胞的分隔，又保持了真核生物和相關(guān)原核生物之間緊密的聯(lián)系。該方法也有一定局限性：只能揭示物理上緊密結(jié)合的相互作用，即在封裝時緊密相連的相互作用，包括共生、捕食、寄生等，但無法區(qū)分相互作用關(guān)系發(fā)生在真核細(xì)胞的內(nèi)部還是外部，也不能探究相互作用的分子機(jī)制。

2.4 聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育和功能信息

2016年，Spencer等［20］首先開發(fā)了epicPCR技術(shù)，并將其用于硫酸鹽還原細(xì)菌的研究，拓展了硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。2019年，Qin等［78］用該技術(shù)對青藏高原鹽湖沉積物中硫酸鹽還原原核生物（Sulfatereducing prokaryotes，SRPs）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了鑒定，研究表明西藏鹽湖中有多種新的特有的SRP。隨后，研究者將epicPCR技術(shù)用于抗性基因及其宿主的研究。由于抗性基因相對豐度較低且易在宿主間轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的研究方法存在很大局限性，epicPCR技術(shù)的應(yīng)用大大提高了抗性基因風(fēng)險(xiǎn)評估的精確度水平［79］。

2017年，Lan等［21］首先提出了結(jié)合微流控技術(shù)、片段化和序列標(biāo)簽的單細(xì)胞基因組測序Sic-seq，并使用這種方法來分析了環(huán)境樣本中微生物耐藥基因、毒力因子和噬菌體序列的分布。2020年，Chijiiwa等［80］發(fā)現(xiàn)借助單細(xì)胞基因組測序技術(shù)可以在沒有參考基因組的情況下在物種水平上識別代謝應(yīng)答者，為區(qū)分鑒定微生物群落中具有特定功能的未培養(yǎng)微生物提供了方法。Doud等［81］通過識別和捕獲基于其原位功能或特征的單個微生物，擴(kuò)充了功能驅(qū)動的單細(xì)胞基因組學(xué)。該方法先用熒光標(biāo)記微生物含有的纖維素顆粒，然后通過熒光激活細(xì)胞分選方法分離單細(xì)胞進(jìn)行宏基因組鳥槍法測序，結(jié)合16S rRNA基因擴(kuò)增子測序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育定位，并對纖維素酶進(jìn)行基因鑒定、表達(dá)檢測和活性測試。這種功能驅(qū)動的單細(xì)胞方法可以將微生物分類直接與原位功能聯(lián)系起來，具有廣泛的應(yīng)用前景和重大的實(shí)際意義。

3 總結(jié)與展望

2018年12月，英國皇家學(xué)會舉辦了一場以“單細(xì)胞生態(tài)學(xué)”為主題的跨學(xué)科會議，使用物理和分子領(lǐng)域相關(guān)的最新方法，在單細(xì)胞尺度研究生物現(xiàn)象，揭示同一物種的個體（或個體群）與其他個體、環(huán)境，以及不同種個體的相互作用［82］。操縱細(xì)胞的物理學(xué)家、研究微生物群落性質(zhì)的微生物學(xué)家和開發(fā)新的單細(xì)胞方法的基因組學(xué)家齊聚一堂，產(chǎn)生了諸多新的見解與靈感。現(xiàn)在正是單細(xì)胞測序技術(shù)的飛速發(fā)展期，它的產(chǎn)生與完善推動了多個學(xué)科的進(jìn)展，在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用又促進(jìn)了技術(shù)的成熟。目前已有一些較成熟的單細(xì)胞測序平臺和商品化試劑盒上市，如10×genomic公司的10×Chromium Single Cell Gene Expression Solution 和Chromium Single Cell DNA Reagent Kits，BD公司的BD RhapsodyTMSingle-Cell Analysis System，Wafergen公司的ICELL8 Single-Cell System，Bio-Rad公 司 的SureCell ATACSeq Library Preparation Kit和與Illumina合作開發(fā)的llumina?Bio-Rad?Single-Cell Sequencing Solution等。但由于單細(xì)胞測序的成本依然較高而能夠同時檢測的細(xì)胞數(shù)量也較為有限，其主要的應(yīng)用熱點(diǎn)依然以醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)橹?，環(huán)境微生物和微生物生態(tài)的應(yīng)用才剛剛起步。而根據(jù)微生物生態(tài)研究的特點(diǎn)，領(lǐng)域內(nèi)也有專家對單細(xì)胞測序的儀器使用方法進(jìn)行了一系列優(yōu)化，如結(jié)合單細(xì)胞測序技術(shù)將復(fù)雜群落分割成多個微型亞群再進(jìn)行宏基因組測序的微型宏基因組（Mini-metagenome）技術(shù)［83］，該技術(shù)降低了樣品復(fù)雜性，同時具有傳統(tǒng)宏基因組測序所不具備的單細(xì)胞分辨率，與單細(xì)胞技術(shù)相比又提高了測序通量，解決了嵌合體問題，非常適用于環(huán)境樣本。單細(xì)胞測序技術(shù)有望成為微生物生態(tài)研究強(qiáng)大有力的主流技術(shù)力量，對于深入研究不可培養(yǎng)的微生物、加深對微生物生命之樹的探索具有重大意義。