李 娜，姚 麗

(連云港市第二人民醫(yī)院東院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港 222000)

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，且男性發(fā)病率略高于女性，成為威脅人群健康、生命的主要疾病之一[1]。肺癌病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為與長(zhǎng)期大量吸煙、職業(yè)、電離輻射及遺傳因素有關(guān)[2]。患者發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，隨著病情的發(fā)展可表現(xiàn)為局部癥狀、全身癥狀、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移癥狀等[3]。目前，臨床上對(duì)于肺癌以手術(shù)、化療治療為主，雖然能延緩病情發(fā)展，延長(zhǎng)患者壽命，但是部分患者治療后由于缺乏有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)，導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率較高，難以達(dá)到預(yù)期的治療效果[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是指從原發(fā)病灶進(jìn)入外周血液中的腫瘤細(xì)胞，但是臨床上，關(guān)于CTC水平與預(yù)測(cè)肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)性研究較少[5]。因此，本文探討CTC在預(yù)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年4月至2015年4月治療的肺癌患者71例作為對(duì)象，設(shè)為觀察組，男41例，女30例，年齡35～88歲，平均(61.20±6.71)歲；病理類型：鱗癌25例，腺癌27例，腺鱗癌19例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期37例；分化程度：低分化23例，中分化36例，高分化12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合肺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均經(jīng)病理組織檢查確診；(2)所有患者均為初次診斷，能在醫(yī)生指導(dǎo)下完成有關(guān)檢查與治療。選擇同期在本院體檢健康者55例，設(shè)為對(duì)照組，男30例，女25例，年齡34～87歲，平均(60.28±6.69)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它肺部疾病或其它惡性腫瘤者；(2)合并精神異常、認(rèn)知功能障礙、自身免疫系統(tǒng)疾病或凝血功能異常者；(3)近期使用其它方法治療或影響預(yù)后評(píng)估者。兩組臨床資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 儀器與設(shè)備

Abbott i2000全自動(dòng)免疫分析儀(雅培公司)、常溫臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)：TDL-40C)(上海安亭儀器公司)、Promax搖床(德國(guó)海盜爾夫Heidolph公司)、GL-802B型微型臺(tái)式真空泵(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、熒光顯微鏡(上海順宇科技有限公司)、原位雜交儀(美國(guó)Westwood公司)、DAPI熒光保存液(賽特生物醫(yī)藥科技有限公司)、Triton X-100(上海波光生物科技有限公司)。

1.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集方法

1.3.1 標(biāo)本采集 觀察組患者均為初次診斷后入院治療，分別于治療前和治療完成后，采集患者早晨空腹靜脈血10 mL，對(duì)照組健康體檢當(dāng)天空腹?fàn)顟B(tài)下取靜脈血10 mL，并放置在含EDTA的抗凝管中備用。

1.3.2 磁珠富集 取淋巴細(xì)胞分離液與血液標(biāo)本，混合后進(jìn)行加熱，控制加熱溫度為18～25 ℃，充分混合抗凝血7.5 mL及等量PBS液，經(jīng)貼壁后緩慢導(dǎo)入淋巴細(xì)胞分離層，常溫下進(jìn)行20 min離心，離心力1463 g，獲得環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，采用PBS清洗2次，15 min離心，離心力1463 g。將細(xì)胞沉淀懸浮在磁珠緩沖液80 μL中，向緩沖液中加入CD45抗體20 μL，充分混合后進(jìn)行15 min孵育，溫度為4 ℃，加入磁珠緩沖液2 mL，10 min離心，離心力1463 g。去除上層清液，向獲得的細(xì)胞沉淀中加入緩沖液500 μL完成細(xì)胞重懸，經(jīng)磁珠MS分流柱后加入磁珠緩沖液500 μL，采用MS分流柱進(jìn)行2次清洗。取分流柱分流出的液體，10 min離心，離心力1463 g后去除上清，將細(xì)胞沉淀放置在防脫載玻片中風(fēng)干，在濃度為4%多聚甲醛中固定，見圖1[7]。

圖1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集過(guò)程部分示意圖

1.4 熒光染色

利用PBS對(duì)制備的載玻片進(jìn)行3次清洗，每次清洗5 min，清洗完畢后采用BAS進(jìn)行0.5 h封閉，然后，再用PBS清洗3次，每次5 min。向獲得的溶液中加入小鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白，4 ℃下過(guò)夜，PBS清洗3次，每次5 min，然后向溶液中加入小鼠IgG(采用FITC標(biāo)記)，常溫下孵育120 min，PBS清洗3次，每次5 min。在細(xì)胞區(qū)域加入DAPI感染的細(xì)胞核7 μL，加入蓋玻片封固，在免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照[8-9]。

1.5 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估

統(tǒng)計(jì)觀察組患者的性別、年齡、腫瘤病理類型、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后等資料，分析CTC陽(yáng)性率與患者臨床病理特征和預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

患者預(yù)后情況采用recist標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)[10]：①完全緩解(CR)：病灶全部消失；②部分緩解(PR)：病灶范圍較前縮小30%以上；③疾病穩(wěn)定(SD)：病灶范圍縮小不超過(guò)30%，增大小于20%；④疾病進(jìn)展(PD)：病灶范圍增大超過(guò)20%或出現(xiàn)新發(fā)的轉(zhuǎn)移灶或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。將CR、PR歸為預(yù)后良好，將SD、PD歸為預(yù)后一般。CT和MRI等影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶和局部有新的病灶出現(xiàn)定義為肺癌復(fù)發(fā)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大腦或肝臟、脾臟、骨骼等其它部位轉(zhuǎn)移病灶時(shí)定義為肺癌轉(zhuǎn)移。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組CTC陽(yáng)性率比較

觀察組有39例發(fā)現(xiàn)CTC陽(yáng)性，CTC陽(yáng)性率為54.93%，對(duì)照組有2例CTC陽(yáng)性，CTC陽(yáng)性為3.64%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明肺癌患者外周血CTC陽(yáng)性率高于健康人群。

2.2 CTC陽(yáng)性率與患者臨床病理特征和預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

肺癌患者CTC陽(yáng)性率與腫瘤分期、分化程度、預(yù)后、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期腫瘤、低分化程度、預(yù)后一般、存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，其CTC陽(yáng)性率明顯大于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤、中高分化程度、預(yù)后良好、不存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肺癌患者CTC陽(yáng)性率與性別、年齡、病理類型無(wú)關(guān)，不同性別、年齡和病理類型的患者，其CTC陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 肺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后與CTC陽(yáng)性率相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：肺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與CTC陽(yáng)性率呈正相關(guān)性(P<0.05)；肺癌患者預(yù)后與CTC陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見表2。

3 討 論

目前，臨床上對(duì)于肺癌以手術(shù)治療、放化療為主，手術(shù)能有效的切除病灶組織，延長(zhǎng)患者壽命[11]；放化療則能殺死腫瘤組織，控制病情持續(xù)發(fā)生。但是，無(wú)論何種治療方法均存在明顯的局限性，再加上患者治療后由于缺乏有效的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，導(dǎo)致患者死亡率、復(fù)發(fā)率較高，影響患者預(yù)后[12]。

表1 39例CTC陽(yáng)性患者臨床病理特征和預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

表2 肺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后與CTC陽(yáng)性率相關(guān)性

目前臨床上對(duì)于肺癌的診斷、預(yù)后和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判斷主要依靠CT、MRI等影像學(xué)檢測(cè)以及病理活檢手段，然而這些手段對(duì)于微小病灶的檢出能力有限，很難做出準(zhǔn)確的判斷，而且在肺癌的治療過(guò)程中很難實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。CTC不同于影像檢查和病理診斷，只需要通過(guò)采集外周血即可獲取，所以能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在肺癌的治療過(guò)程中，可通過(guò)CTC的動(dòng)態(tài)變化來(lái)評(píng)估治療效果，從而及時(shí)調(diào)整肺癌的治療方案。此外CTC在肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中也有重要作用，影像學(xué)檢測(cè)是無(wú)法判斷患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)能夠檢測(cè)到病灶存在時(shí)實(shí)際上已經(jīng)發(fā)生了復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。而CTC則不同，腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移主要就是通過(guò)血液系統(tǒng)傳播的，可以通過(guò)檢測(cè)血液中的CTC，提前評(píng)估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中，觀察組肺癌患者中CTC陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明CTC在肺癌患者中陽(yáng)性率較高，能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。CTC最早在19世紀(jì)首次提出，后經(jīng)不斷研究探索發(fā)現(xiàn)其存在于惡性腫瘤患者外周血循環(huán)中，且在良性疾病或健康人群中水平較低。對(duì)于肺癌患者而言，腫瘤細(xì)胞可自發(fā)，亦可由于治療過(guò)程中擠壓、器械觸碰等進(jìn)入血液中[13]。部分CTC進(jìn)入外周循環(huán)中可以通過(guò)機(jī)體免疫識(shí)別及自然殺傷細(xì)胞作用而凋亡，僅有極少數(shù)CTC能逃避免疫監(jiān)視存活，并且通過(guò)遷移、相互聚集、黏附等方式形成微小癌栓，在特定的作用下演變?yōu)檗D(zhuǎn)移灶，從而影響患者預(yù)后。本研究中，觀察組肺癌組織中CTC陽(yáng)性率與腫瘤分期、分化程度、預(yù)后、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明CTC在肺癌患者中水平受到的影響因素較多，加強(qiáng)CTC細(xì)胞測(cè)定能反應(yīng)患者的疾病嚴(yán)重程度。臨床研究表明[14]：對(duì)于肺癌患者而言，CTC檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)患者預(yù)后具有更高的敏感性，它能對(duì)患者疾病嚴(yán)重程度和治療效果進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估[15]。本研究中，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：肺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與CTC陽(yáng)性率呈正相關(guān)性(P<0.05)；肺癌患者預(yù)后與CTC陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，說(shuō)明CTC細(xì)胞陽(yáng)性率與患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)存在緊密的聯(lián)系。

綜上所述，CTC在肺癌患者中陽(yáng)性率較高，能預(yù)測(cè)患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，有助于評(píng)估患者預(yù)后，能為臨床治療方案的調(diào)整提供依據(jù)和參考。