楊 倩，劉 媛，李威威

(保定市第一中心醫(yī)院 1.眼三科，2.眼二科，河北 保定 071000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是2型糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致視力永久性喪失[1]。近年來(lái)，伴隨我國(guó)2型糖尿病發(fā)病率的增加，2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率也隨之增加，已嚴(yán)重影響人們的健康及正常生活[2]。有研究表明[3]，糖尿病患者視網(wǎng)膜對(duì)高糖及低氧刺激敏感，進(jìn)而誘發(fā)促血管生成和抑制血管生成的失衡，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變。目前，臨床常用激光手術(shù)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制劑治療2型糖尿病視網(wǎng)膜病變，但二者均對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞有一定傷害[4]。因此，研發(fā)傷害性較低的用于治療2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物具有重要意義。蝦青素是唯一能通過(guò)血腦屏障的一種類(lèi)胡蘿卜素，廣泛存在于自然界中[5]。相關(guān)研究表明[6-7]，蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以有效清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，對(duì)心血管疾病、糖尿病等疾病的預(yù)防及治療有一定作用。既往研究表明蝦青素對(duì)糖尿病腎病有一定的保護(hù)作用[8]，可通過(guò)上調(diào)核因子E2相關(guān)因子和NAD(P)H醌氧化還原酶1(nicotinamide quinone oxidoreductase 1,NQO1)抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。但是對(duì)于2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用還有待探討，因此，本實(shí)驗(yàn)探討蝦青素對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠70只，SPF級(jí)，8周齡，體重質(zhì)量220～230 g，購(gòu)自于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0008。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按照2006版《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處理。

1.2 試劑與儀器

蝦青素(HPLC≥98%，上海北諾生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；活性氧(ROS)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司)；VEGF抗體和色素上皮衍生因子(PEDF)抗體(美國(guó)abcam公司)；Tecan Freedom EVOlyzer?全自動(dòng)酶免工作站(帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)；日立7100全自動(dòng)生化分析儀(廣州東林生物科技有限公司)；DYCP-31C型電泳儀及配套電泳槽(北京六一公司)等。

1.3 模型構(gòu)建[9]

70只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取60只大鼠，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ 30 mg/kg)并持續(xù)高糖高脂飼料飼養(yǎng)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。10只正常組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)。造模后第五天，檢測(cè)各組大鼠血糖，若血糖>16.7 mmol/L則2型糖尿病大鼠造模成功。其中30只大鼠造模成功，30只大鼠造模失敗，予以剔除。所有大鼠自由飲水、檢測(cè)血糖，每2周進(jìn)行一次眼底檢查，2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管即2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型成功。將2型糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)炷３晒Φ?0只大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、低劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組，每組各10只。低劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠給予蝦青素15 mg/kg灌胃處理，高劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠給予蝦青素30 mg/kg灌胃處理，給藥劑量參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]。模型組及正常組大鼠均給予同等劑量生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 視網(wǎng)膜組織HE染色 取每組10只大鼠左眼視網(wǎng)膜組織，行HE染色。采用腹腔注射戊巴比妥鈉(0.3 g/100 g)麻醉大鼠并處死，摘取眼球浸入眼球固定液中固定，取視網(wǎng)膜組織，依次石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，然后進(jìn)行HE染色，觀察視網(wǎng)膜組織病理變化。

1.4.2 視網(wǎng)膜組織中ROS、CAT和SOD水平檢測(cè) 取每組10只大鼠右眼視網(wǎng)膜組織，研磨成組織勻漿，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取離心后上清液，-20 ℃冰箱中保存，待驗(yàn)。采用免疫沉淀法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中ROS、CAT和SOD水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4.3 視網(wǎng)膜組織中PEDF和VEGF水平檢測(cè) 用蛋白質(zhì)免疫印跡法[10]檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中PEDF和VEGF水平。步驟如下：取實(shí)驗(yàn)1.4.2中組織勻漿至試管中，首先加入RIPA裂解液用于提取組織中總蛋白；而后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行PEDF及VEGF定量檢測(cè)。具體過(guò)程：80 V凝膠電泳15 min，電壓增加至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面；轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜；滴加二抗，室溫下孵育2 h；曝光顯影，用Image J1.8.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組視網(wǎng)膜組織病理變化

由圖1可知，正常組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)新生血管生成；模型組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)不清晰，神經(jīng)纖維層伴水腫，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列疏松，有新生血管生成；低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列較整齊，新生血管生成均較模型組有明顯改善，且高劑量實(shí)驗(yàn)組改善效果優(yōu)于低劑量實(shí)驗(yàn)組。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織病理切片(HE，40×)A：正常組；B：模型組；C：低劑量實(shí)驗(yàn)組；D：高劑量實(shí)驗(yàn)組

2.2 各組視網(wǎng)膜組織中ROS、CAT和SOD水平比較

四組視網(wǎng)膜組織中ROS、CAT和SOD水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，高劑量實(shí)驗(yàn)組ROS、CAT和SOD水平改善程度優(yōu)于低劑量實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組ROS、CAT和SOD水平比較

2.3 各組視網(wǎng)膜組織中PEDF和VEGF水平比較

由表2、圖2可知，四組視網(wǎng)膜組織中PEDF和VEGF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中PEDF水平降低，VEGF水平升高(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中PEDF水平升高，VEGF水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中PEDF水平高于低劑量實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，VEGF水平低于低劑量實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

表2 四組PEDF和VEGF水平比較

圖2 四組PEDF和VEGF蛋白表達(dá)A：正常組；B：模型組；C：低劑量實(shí)驗(yàn)組；D：高劑量實(shí)驗(yàn)組

3 討 論

糖尿病是由遺傳、環(huán)境及生活方式等多種誘因引起的以高血糖為特征的代謝性疾病[11]。糖尿病還會(huì)產(chǎn)生的并發(fā)癥有糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等[12]。蝦青素在糖尿病腎病中的保護(hù)作用已有研究，但是蝦青素對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飼料飼養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，通過(guò)觀察蝦青素干預(yù)后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化、氧化應(yīng)激及血管新生等相關(guān)指標(biāo)，探究其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用，為蝦青素臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)不清晰，神經(jīng)纖維層伴水腫，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列疏松，有新生血管生成，該結(jié)果表明2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型造模成功。給予蝦青素干預(yù)后，低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)、外核層細(xì)胞排列均較模型組有所改善，提示蝦青素對(duì)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變有較好的治療作用，可修復(fù)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變，且隨蝦青素給藥劑量增加，其改善效果越為明顯。

最近研究發(fā)現(xiàn)蝦青素有較強(qiáng)的抗氧化能力[13-15]。ROS是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，檢測(cè)ROS水平可了解膜脂過(guò)氧化的程度[16]。SOD同樣能夠反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平[17]。CAT是存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[18]。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低。給予蝦青素干預(yù)后，低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，該結(jié)果表明蝦青素可有效改善高糖及低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，提高組織內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶CAT和SOD水平，發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

PEDF是絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族的成員，能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的新生血管抑制作用，同時(shí)是細(xì)胞外神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)組織的發(fā)育和生長(zhǎng)有重要作用[19]。糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制是視網(wǎng)膜缺血、缺氧造成眼內(nèi)VEGF大量表達(dá)，VEGF會(huì)與高親和力受體結(jié)合從而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致新生血管形成[20]。本研究給予蝦青素干預(yù)后，低、高劑量實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中PEDF水平升高，VEGF水平降低，且隨蝦青素給藥劑量增加，其改善效果越明顯。上述結(jié)果說(shuō)明蝦青素可有效通過(guò)上調(diào)PEDF表達(dá)，下調(diào)VEGF表達(dá)抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，從而保護(hù)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞免受損傷。

綜上所述，蝦青素可有效改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變，其機(jī)制可能與調(diào)控PEDF和VEGF表達(dá)，抗氧化應(yīng)激有關(guān)。