徐慶東，郭煥開(kāi)，蘇 明，陳潔欣，馬惠娟，鄧?yán)^鴻，姜松青，石曉峰

(江門(mén)市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 江門(mén) 529000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床療效不甚理想，因此，進(jìn)一步探索DN發(fā)病機(jī)制，尋求新的有效的防治措施對(duì)治療DN具有重要意義。腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubular interstitial fibrosis，RTIF)是DN的主要病理變化之一[1]，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DN的發(fā)病進(jìn)程中，腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞，即上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)使細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，引起腎小管間質(zhì)纖維化、變性、萎縮、消失[2]。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因編碼的蛋白具有抗纖維化效應(yīng)[3]，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(eroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PTEN，延緩DN進(jìn)展[4]。本研究通過(guò)探索糖尿病小鼠及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ、PTEN的表達(dá)變化，擬進(jìn)一步完善PPARγ、PTEN與糖尿病的EMT和腎纖維化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

C57BL小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量為(30±5)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購(gòu)自Sigma(美國(guó))公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自cell signaling technology(CST)公司；4%多聚甲醛(polyformaldehyde，PFA)磷酸緩沖液、中性樹(shù)膠封片劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma(美國(guó))公司；雙花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin，DBA)試劑盒、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、低分子量蛋白Marker、RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒為賽默飛世爾科技產(chǎn)品。一抗鼠抗β-actin、一抗兔抗PPARγ、一抗兔抗PTEN、兔抗E-cadherin、鼠抗α-SMA、兔抗CollagenⅢ、二抗生物素標(biāo)記羊抗兔、二抗羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)等抗體均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)完成。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將本室凍存的NRK-52E大鼠腎細(xì)胞株，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，48 h換液一次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組 根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，將細(xì)胞分為正常糖量的對(duì)照組和高糖量的實(shí)驗(yàn)組，在2% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，對(duì)照組的葡萄糖濃度為5.5%；實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖濃度為25%，分別在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞48 h，然后，分別用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase reaction，qRT-PCR)測(cè)定目標(biāo)蛋白和基因的表達(dá)。

1.4 糖尿病(DM)小鼠模型的構(gòu)建

STZ溶于無(wú)菌的pH4.5，0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，腹腔注射給予C57BL小鼠STZ溶液55 mg/kg，連續(xù)注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽(yáng)性即為糖尿病小鼠(實(shí)驗(yàn)組)。

另取正常小鼠10只作為對(duì)照組，腹腔注射無(wú)菌pH4.5、0.01 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測(cè)血糖。實(shí)驗(yàn)期間兩組小鼠均正常飲食飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8周，處死小鼠，取腎臟，一側(cè)腎臟固定于4% PFA溶液中制作石蠟切片，進(jìn)行病理檢查、免疫組化檢測(cè)。另一側(cè)腎臟加入生理鹽水研磨，提取總蛋白和RNA，進(jìn)行Western Blot、qRT-PCR檢測(cè)。

1.5 腎組織病理學(xué)檢測(cè)

腎組織用中性甲醛固定制成石蠟切片，分別用蘇木精-伊紅(Hatmatoxylin-Eosin，HE)、高碘酸-無(wú)色品紅(periodic acid solferino，PAS)、Masson、高碘酸烏洛托品銀(periodic acid-silver-methenamine，PASM)進(jìn)行染色，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，光鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及纖維化情況。

1.6 Western blot檢測(cè)

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細(xì)胞，提取總蛋白，Western blot檢測(cè)PPARγ、PTEN蛋白、EMT蛋白、α-SMA，CollagenⅢ、E-cadherin蛋白表達(dá)情況。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細(xì)胞，提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)PPARγ、PTEN mRNA表達(dá)情況。PPARγ引物：上游為5′-CGCAGTTCTGAGCUGGCGACT-3′，下游為5′-TGGACAGACCCGAACTGATGG-3′；PTEN引物：上游為5′-CTTAAGTTCAGTCCGGAACTTG-3′，下游為：5′-GGCATCAGCATGGAACTAGAC-3′，內(nèi)參引物：5′-GAATGCTGACTGGGAAATTGAG-3′，下游為：5′-ACATTCATCATGGCAGTAACT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)10 min后，在95 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共循環(huán)40次，重復(fù)3次，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用RQ=2-△△Ct計(jì)算PPARγ、PTEN mRNA表達(dá)情況。

1.8 熒光素酶檢測(cè)PPARγ轉(zhuǎn)錄活性

氧化酶體增殖物反應(yīng)原件熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Addgene plasmid 1015)由本實(shí)驗(yàn)室保存，取兩組腎組織及腎小管上皮細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后將相同數(shù)量各組系膜細(xì)胞裂解，加反應(yīng)底物，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠腎組織病理變化

如見(jiàn)圖1所示，腎組織分別用HE、PAS、PASM染色，對(duì)照組小鼠腎小球及基底膜形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)清晰，腎小管未出現(xiàn)擴(kuò)張、壞死、硬化等現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小球系膜增生、出現(xiàn)同心圓狀的結(jié)節(jié)狀硬化。腎小管管腔擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規(guī)則增厚，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管間質(zhì)區(qū)PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)增多。Masson染色顯示，對(duì)照組未出現(xiàn)膠原沉積，實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小管管腔明顯擴(kuò)張、腎小球及腎間質(zhì)見(jiàn)大量被染成藍(lán)紫色條索狀的膠原纖維沉積。

圖1 兩組小鼠腎組織HE、PAS、Masson、PASM染色(400×)

2.2 小鼠腎組織及腎小管上皮細(xì)胞中PPARγ、PTEN蛋白的表達(dá)

Western Blot顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腎組織及及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，見(jiàn)圖2)。

2.3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細(xì)胞中PPARγ、PTEN mRNA的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ、PTEN mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，見(jiàn)圖3)。

圖2 兩組小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達(dá)水平A：電泳圖，B：PPARγ、PTEN與β-actin比值的相對(duì)密度圖；與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細(xì)胞中PPARγ、PTEN mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.4 小鼠腎組織EMT及纖維化

Western Blot顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.01，見(jiàn)圖4)。

2.5 小鼠腎組織及及腎小管上皮細(xì)胞PPARγ轉(zhuǎn)錄活性

與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腎組織及及腎小管上皮細(xì)胞PPARγ轉(zhuǎn)錄活性均明顯增高(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖4 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)水平A：電泳圖，B：三種檢測(cè)蛋白與β-actin比值的相對(duì)密度圖；與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖5 兩組小鼠腎組織及及腎小管上皮細(xì)胞PPARγ轉(zhuǎn)錄活性與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.6 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)量相關(guān)性進(jìn)行分析，PTEN與PPARγ及E-cadherin呈顯著正相關(guān)，與α-SMA、Collagen-Ⅲ呈顯著負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討 論

PTEN基因定位于人類(lèi)第十號(hào)染色體上[5]，該基因能編碼具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶，是一種雙重活性抑癌基因[6]。過(guò)往對(duì)PTEN的研究主要集中于腫瘤，能參與調(diào)控多條信號(hào)通路及細(xì)胞周期蛋白通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、遷移、黏附、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成等作用[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，PTEN是足細(xì)胞胰島素敏感性調(diào)控的關(guān)鍵分子之一，是引發(fā)DN的重要因子[8]。DN發(fā)病時(shí)，PTEN表達(dá)降低，與腎組織纖維化密切相關(guān)[9]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一種核轉(zhuǎn)錄因子[10]，是核受體超家族成員，有α、β、γ三種亞型[11]。其中，PPARγ在腎小球、近曲小管、腎臟纖維細(xì)胞等組織中有廣泛表達(dá)[12]，研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，PPARγ能直接降低尿蛋白而不降低血糖[13]。而且，PPARγ通過(guò)與PTEN上游的過(guò)氧化物酶體增生物反應(yīng)元件結(jié)合，參與PTEN的調(diào)控[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)高糖處理后，DN小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ、PTEN的蛋白及mRNA表達(dá)水平均較正常小鼠顯著降低，提示高糖不僅使PPARγ表達(dá)水平降低，還降低PTEN的表達(dá)水平，且蛋白和mRNA降低水平和趨勢(shì)相同。有文獻(xiàn)報(bào)道，PPARγ轉(zhuǎn)錄活性在系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中具有重要作用，與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而高糖可抑制PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。本文結(jié)果顯示，DN小鼠腎組織及及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，PPARγ轉(zhuǎn)錄活性均明顯低于對(duì)照組。

Iwano等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，36%的間質(zhì)成纖維細(xì)胞來(lái)源于RTECs，說(shuō)明間質(zhì)成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源是EMT。EMT發(fā)生時(shí)，EMT的標(biāo)志性蛋白表達(dá)發(fā)生改變，如波形蛋白(Vimentin)被激活，α-SMA表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)減少[16]。本研究結(jié)果顯示，正常小鼠腎組織和腎小管上皮細(xì)胞中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平較高，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)水平較低，DN小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，提示高糖能促進(jìn)EMT的進(jìn)展，促進(jìn)腎組織和腎小管上皮細(xì)胞纖維化。對(duì)小鼠腎組織進(jìn)行HE、PAS、PASM、Masson染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小球系膜增生、出現(xiàn)同心圓狀結(jié)節(jié)狀硬化；腎小管管腔擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規(guī)則增厚，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管間質(zhì)區(qū)PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)增多，小鼠腎小管管腔明顯擴(kuò)張，腎小球及腎間質(zhì)見(jiàn)大量被染成藍(lán)紫色條索狀的膠原纖維沉積，提示在發(fā)生EMT時(shí)，確實(shí)發(fā)生了腎小管間質(zhì)纖維化。對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，PTEN與PPARγ(r=0.71)及E-cadherin(r=0.62)的表達(dá)呈正相關(guān)，與α-SMA(r=-0.66)、Collagen-Ⅲ(r=-0.59)的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。

綜上所述，機(jī)體在高糖的環(huán)境中，腎組織和腎小管上皮細(xì)胞中的PPARγ與PTEN的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin，上調(diào)α-SMA、Collagen-Ⅲ的表達(dá)下調(diào)，腎組織出現(xiàn)EMT及纖維化改變。其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。