王 晨，鄭祖艷△，苗永新，張琳琳

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)附屬黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

焦慮癥是以焦慮為主要特征的神經(jīng)癥，根據(jù)《中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》，焦慮癥可分為GAD和PD兩種類型[1]。臨床上以GAD為多見，主要表現(xiàn)為過度憂慮，伴失眠、易激惹、坐立不安，或感到緊張、易疲勞、注意力不能集中等。臨床藥物治療多采用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)、三環(huán)類抗抑郁藥(TCA)及苯二氮卓類藥物等[2]。隨著人們對藥物治療焦慮癥導(dǎo)致副作用認(rèn)知的深入，針刺治療焦慮癥的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。頭穴叢刺法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于治療精神障礙類疾病，但有關(guān)機(jī)理研究尚不確切，故本研究從頭穴叢刺治療焦慮模型小鼠HPAA軸及分子機(jī)制角度出發(fā)，進(jìn)一步證明頭穴叢刺法對焦慮癥的治療作用，對臨床有重要的指導(dǎo)意義。

本實驗?zāi)M人受到應(yīng)激刺激的過程，從心理應(yīng)激與生理應(yīng)激兩方面選擇高架十字迷宮實驗(EPM)[3-4],與間氯苯哌嗪(mCPP)共同誘導(dǎo)焦慮模型小鼠，基于此探討頭穴叢刺對焦慮癥的治療效果及作用機(jī)理，從而為臨床治療提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級8周雄性SD小鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心購買。室溫(20±2)℃，自由食、水飼養(yǎng)；適應(yīng)環(huán)境1周后正式實驗。實驗遵照《實驗動物倫理與福利》等相關(guān)要求。

1.2 試劑與儀器

電子秤(天津醫(yī)療器械廠)，-70 ℃冰箱(日本日立公司)，安迪牌針灸針(0.25 mm×25 mm)，恒溫高速離心機(jī)(日立公司)，電針治療儀(鑫升實業(yè)有限公司)，BA200數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪公司)，Image-ProP-lus6.0圖像分析系統(tǒng)(MediaCy-bernetics公司)，十字迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(泰盟科技有限公司)[5]。

1.3 造模方法與分組

造模方法參照Bondi CO等的方法[6],將小鼠隨機(jī)分成3組，然后分別注射生理鹽水、mCPP 1 mg/kg、mCPP 2 mg/kg,20 min后將小鼠置于EPM的平臺處，使小鼠面對其中一個開放臂，釋放后開始記錄5 min內(nèi)的以下指標(biāo)：①OE(進(jìn)入開臂次數(shù))：以小鼠四爪均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，一個爪子從該臂中完全退出則為結(jié)束；②OT(進(jìn)入開臂時間)：單位為s；③CE(進(jìn)入封臂次數(shù))：標(biāo)準(zhǔn)同①；④CT(進(jìn)入封臂時間)：單位為s；⑤OT%(開臂停留時間百分比)：開臂停留時間/總時間×100%；⑥OE%(進(jìn)入開臂次數(shù)百分比)：進(jìn)入開放臂次數(shù)/(OE+CE)×100%,并選擇OT%和OE%最高的40只小鼠。通過SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對40只造模成功的小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，其中20只進(jìn)入針刺組、20只進(jìn)入模型空白組，另選20只不造模、不針刺的小鼠設(shè)為空白對照組。

1.4 針刺方法

造模成功后，將針刺組小鼠固定，參照《實驗動物穴位圖譜》定位，在頂前區(qū)及頂區(qū)分別以前神聰、百會、后神聰為中心,取穴為前神聰及前神聰兩側(cè)各旁開1寸及2寸平行線,百會兩側(cè)各旁開0.5寸及1.5寸平行線,以及后神聰及后神聰兩側(cè)旁開1寸平行線,共12針呈楔形分布[7]，針刺方法為向后平刺快速進(jìn)針，使針刺入小鼠頭皮下約20 mm，并迅速捻轉(zhuǎn)，每日1次，每次15 min,連續(xù)治療21 d，模型空白組與空白對照組同時進(jìn)行與針刺組相同的固定，不進(jìn)行針刺治療。

1.5 行為學(xué)測試方法

各組小鼠在實驗結(jié)束后第2天，再次進(jìn)行EPM，即分別使3組小鼠面對其中一個開臂，釋放小鼠后記錄5 min內(nèi)的OT%、OE%(具體行為學(xué)測試方法同造模方法)，經(jīng)t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

1.6 取材及檢測方法

行為學(xué)測定完畢后，各組小鼠立即用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，每組隨機(jī)取鼠10只，經(jīng)麻醉后取腦，分離小鼠下丘腦(含室旁核、杏仁核)，通過免疫組化法檢測各組小鼠下丘腦內(nèi)CRH、ACTH、CORT和NPY含量。采用酶聯(lián)免疫法檢測血漿中CRH、ACTH和CORT含量。每組另取剩余10只小鼠，分離出下丘腦，低溫離心后取上層清液，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA水平。

1.7 統(tǒng)計方法

2 實驗結(jié)果

實驗造模及行為學(xué)測試過程中，各組小鼠無死亡。實驗過程中，針刺組小鼠死亡1只(因無法耐受針刺)，其他兩組小鼠實驗過程中無樣本損失。

2.1 各組小鼠EPM行為學(xué)復(fù)測比較

針刺組小鼠與模型空白組小鼠治療前OT%、OE%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組小鼠實驗前差異無統(tǒng)計學(xué)意義。針刺組小鼠試驗后與實驗前比較，OT%、OE%均有所提高(P<0.05);與模型空白組小鼠實驗后對比發(fā)現(xiàn)，針刺組OT%、OE%值升高顯著(P<0.05);模型空白組與空白對照組對比可發(fā)現(xiàn)，模型空白組小鼠的OT%、OE%值明顯下降(P<0.05)。EPM復(fù)測結(jié)果顯示，EPM試驗可使小鼠產(chǎn)生焦慮心理，且由于EPM實驗復(fù)測可信度高[8-10]，說明本實驗焦慮小鼠造模成功，且頭穴叢刺法可顯著改善小鼠的恐懼心理和焦慮行為。見表1。

表1 3組小鼠治療前后行為學(xué)測試結(jié)果比較

2.2 3組小鼠血漿CRH、ACTH和CORT含量比較

針刺組與模型空白組比較P<0.05，說明頭穴叢刺可改善小鼠血漿中CRH、ACTH和CORT的濃度。模型空白組與空白對照組相比，小鼠血漿CRH、ACTH和CORT濃度也發(fā)生明顯變化(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠血漿CRH、ACTH和CORT含量比較

2.3 3組小鼠下丘腦中CRH、ACTH、CORT和NPY含量比較

針刺組與模型空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明頭穴叢刺可顯著改善模型小鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT和NPY的濃度。模型空白組與空白對照組比較，CRH、ACTH、CORT和NPY濃度也發(fā)生明顯變化(P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT和NPY含量比較

2.4 3組NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比較

針刺組與模型空白組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可見頭穴叢刺可明顯降低小鼠下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量，模型空白組與空白對照組比較，下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA濃度提高明顯(P<0.05)。見表4、圖1～2。

表4 3組小鼠下丘腦NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比較

注：1～3為針刺組，4～6為模型空白組，7～9為空白對照組。圖1 3組小鼠下丘腦NPY受體Y1 mRNA含量表達(dá)

注：1～3為針刺組，4～6為模型空白組，7～9為空白對照組。圖2 3組小鼠下丘腦NPY受體Y5 mRNA含量表達(dá)

3 討論

焦慮癥是指以反復(fù)發(fā)作的焦慮或驚恐不安為主要特點的神經(jīng)障礙性疾病，典型表現(xiàn)為偶然或持續(xù)的恐懼或憂慮感且難以自控，自主神經(jīng)癥狀也可伴隨出現(xiàn)[11-15]。中醫(yī)學(xué)將焦慮癥歸屬于“郁病”“奔豚氣”“心悸”等范疇[16]，如《素問·舉痛論》提到:“思則心有所存……故氣結(jié)矣”。認(rèn)為七情所致的情志郁結(jié)為主要病機(jī)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為焦慮癥的發(fā)生受HPAA軸所分泌的激素水平的影響。由下丘腦室旁核神經(jīng)元分泌的ADH(抗利尿激素)和CRH(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素)，兩者進(jìn)一步刺激ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)的釋放。ACTH也同時存在一條負(fù)反饋通路作用于下丘腦，在應(yīng)激狀態(tài)如焦慮、精神緊張時可激活HPAA軸，促使CRH、ACTH分泌增加。而腎上腺中CORT含量可反映HPAA軸功能是否發(fā)生變化。當(dāng)CORT含量明顯升高時對HPAA軸功能亢進(jìn)有提示意義[17]。

頭穴叢刺法應(yīng)用于臨床在治療各種情志病方面早已取得顯著療效[18-19]。但相關(guān)實驗研究結(jié)果比較匱乏，因此本實驗從行為學(xué)及分子機(jī)制角度出發(fā)，實驗結(jié)果表明頭穴叢刺組小鼠治療后行為學(xué)測試比較OT%、OE%均明顯高于模型空白組及空白對照組。而頭穴叢刺組小鼠血漿中CRH、ACTH、CORT含量及下丘腦中CRH、ACTH、CORT、NPY及其Y1 mRNA、Y5 mRNA受體含量在實驗結(jié)束后較模型空白組及空白對照組均有顯著改善。頭穴叢刺的原理從神經(jīng)解剖角度而言其主要刺激區(qū)域為頂區(qū)及頂前區(qū)，頂前區(qū)臨近額葉，因此這兩個區(qū)域的病變極大程度上可導(dǎo)致精神癥狀的發(fā)作，頭穴叢刺法可以通過調(diào)節(jié)相應(yīng)大腦皮層功能從而改善腦組織的病理狀態(tài)[20-22]。從選穴角度來看，頭穴叢刺針刺部位均在督脈巡行附近，“督脈者，起于下極之輸……入屬于腦?！蹦X為元神之府，是精神意識的主宰，督脈“入絡(luò)腦”，百會為督脈穴位，根據(jù)經(jīng)脈所過、主治所及的原理，頭穴叢刺具有調(diào)理氣機(jī)、健腦益智和疏經(jīng)通絡(luò)的作用，在治療神志病方面有很大的優(yōu)勢。

因此，本實驗研究結(jié)果表明，頭穴叢刺具有通過抑制焦慮模型小鼠HPAA軸興奮性降低CRF的分泌、改善小鼠焦慮癥狀的效果，可作為證實頭穴叢刺治療焦慮癥有效的科學(xué)實驗依據(jù)，但因本實驗還存在某些不足之處，仍需進(jìn)一步的實驗研究加以論證。