劉祥華,羅湘筠,李文倩

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院 湖南省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲 412000)

骨骼肌萎縮患者主要的臨床表現(xiàn)是肌纖維發(fā)生進(jìn)行性縮小或者消失，患者肌肉質(zhì)量、容積縮小，其骨骼肌運(yùn)動以及內(nèi)分泌功能發(fā)生受損。臨床發(fā)現(xiàn)，骨骼肌萎縮主要包括失神經(jīng)性肌萎縮、衰老性肌萎縮和藥源性肌萎縮等，引起患者肢體運(yùn)動功能障礙，對正常生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1]。目前骨骼肌萎縮的原因較為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，通過研究其發(fā)生機(jī)制，能控制患者骨骼肌萎縮[2]。電針可有效延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮，已經(jīng)有大量的研究證實(shí)，其能改善周圍神經(jīng)損傷的癥狀，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，對靶器官骨骼肌有延緩萎縮作用[3]，目前臨床中關(guān)于電針治療骨骼肌萎縮作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在研究電針對骨骼肌萎縮模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制，為臨床治療骨骼肌萎縮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動物 選取健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠30只(由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，醫(yī)學(xué)動物合格證號：SCXK渝2012-0002)，體質(zhì)量190～220 g，鼠齡8～10周。本研究符合我院研究倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR一抗(美國CST公司提供)；PBS緩沖液(波爾實(shí)驗(yàn)室提供)；MURF1、PGC-1α、FNDC5 ELISA試劑盒(美國Bio-Rad公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌萎縮模型建立 30只大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和電針組，各10只。參考高睿琦[4]文獻(xiàn)，所有大鼠給予10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，在無菌手術(shù)臺上進(jìn)行建模。具體操作：固定，將麻醉后的大鼠固定在干凈的手術(shù)臺中；備皮，將大鼠右后肢充分暴露后，做好消毒的準(zhǔn)備工作；將手術(shù)器械高溫消毒后，沿大鼠大肌間隙進(jìn)行鈍性分離，坐骨神經(jīng)暴露；神經(jīng)缺口建立，將坐骨神經(jīng)剝離，使用手術(shù)剪將電針組和模型組兩組大鼠坐骨神經(jīng)中段切斷后，將兩段進(jìn)行游離段反折，制作2.0 mm的神經(jīng)缺口，假手術(shù)組大鼠只需要將坐骨神經(jīng)暴露，不需要將坐骨神經(jīng)切斷。

1.2.2 電針干預(yù) 大鼠建模2 d后，早9:00將電針組大鼠在柔軟型固定器上進(jìn)行固定，進(jìn)針采用毫針，取穴參照《大鼠穴位圖譜的研制》和《實(shí)驗(yàn)電針學(xué)》進(jìn)行：側(cè)足三里、承山。進(jìn)針5～7 mm后，將側(cè)足三里、承山兩穴與電針儀連接，電針參數(shù)設(shè)置：采用連續(xù)波，頻率為5 Hz，強(qiáng)度1.5 mA。1次/d，每次維持10 min，需要連續(xù)干預(yù)3周。假手術(shù)組和模型組大鼠每天進(jìn)行固定，時間與電針組保持一致。

1.2.3 腓腸肌濕重、干重測定 大鼠建模成功后，采用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)對大鼠進(jìn)行麻醉，將大鼠腓腸肌快速分離，采用電子天平進(jìn)行稱重，主要包括濕重、干重、干重/體重比值。

1.2.4 骨骼肌肌纖維直徑、面積測定 HE染色：快速提取大鼠骨骼肌，使用40 mL/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣6周，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，HE染色，觀察。骨骼肌經(jīng)過HE染色后，采用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)，分析骨骼肌肌纖維直徑、面積，標(biāo)本做4個切面，選擇4個髙倍鏡視野，觀察骨骼肌肌纖維直徑、面積，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.5 骨骼肌相關(guān)蛋白檢測 采用ELISA檢測，將采集到的標(biāo)本，取50 mM碳酸鹽(pH9.5, 0.05 mol/L CB)適當(dāng)稀釋的抗MURF1、PGC-1α、FNDC5 0.1 mL，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，加蓋后溫度4 ℃ 24 h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH7.4, 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1 mL，同時加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，在43 ℃置60 min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入MURF1、PGC-1α、FNDC5的酶標(biāo)抗體0.1 mL，43 ℃置60 min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個孔中加入底物液四甲基聯(lián)苯胺(TMS)，空白孔不加,0.05 mol/L枸櫞酸(10.5 g/L)4.86 mL混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中,臨用時加30% H2O24.0 μL,混勻]0.1 mL，置黑20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。分析MURF1、PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)。

1.2.6 Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western Blot檢測，將采集到的標(biāo)本10 000×g離心處理10 min，取出上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白定量，將50 μg蛋白加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中，100 ℃加熱處理5 min促使蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后取下硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中4 ℃下封閉1 h，封閉結(jié)束后，加一抗(Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR)使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min，加二抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(1∶10 000)，室溫?fù)u動孵育1 h，最后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用DAB染色試劑盒顯色，光密度掃描后進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 電針對骨骼肌萎縮模型大鼠腓腸肌濕重、干重的影響

如表1所示，電針組骨前肌濕重、干重、干重/體重高于模型組，低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組骨前肌濕重、干重、干重/體重低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腓腸肌濕重、干重比較

2.2 電針對骨骼肌萎縮模型大鼠骨骼肌肌纖維直徑、面積的影響

如表2所示，電針組骨骼肌肌纖維直徑、面積高于模型組，低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組骨骼肌肌纖維直徑、面積低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠骨骼肌肌纖維直徑、面積比較

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠骨骼肌肌纖維分布均勻，排列整齊，纖維之間的間隙保持一致，細(xì)胞核主要在肌細(xì)胞周圍散布。模型組大鼠骨骼肌肌纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則，排列混亂，肌纖維發(fā)生萎縮，纖維之間的間隙增大,細(xì)胞核大小不一致，分布不規(guī)律。電針組大鼠骨骼肌肌纖維萎縮程度低于模型組，細(xì)胞核增加呈聚集分布。

圖1 3組大鼠骨骼肌病理學(xué)觀察(HE染色，200×)

2.3 電針對骨骼肌萎縮模型大鼠骨骼肌相關(guān)蛋白的影響

如表3所示，電針組骨骼肌相關(guān)蛋白MURF1表達(dá)低于模型組，PGC-1α、FNDC5表達(dá)高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針組骨骼肌相關(guān)蛋白MURF1表達(dá)高于假手術(shù)組，PGC-1α、FNDC5表達(dá)低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組骨骼肌相關(guān)蛋白MURF1表達(dá)高于假手術(shù)組，PGC-1α、FNDC5表達(dá)低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠骨骼肌相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4 電針對骨骼肌萎縮模型大鼠Akt/mTOR通路的影響

如表4所示，電針組Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表達(dá)高于假手術(shù)組和模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表達(dá)低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白(WB圖)

表4 各組大鼠Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白比較

3 討論

骨骼肌萎縮發(fā)生的主要原因是因?yàn)闄C(jī)體中肌蛋白合成顯著減少，分解過多，許壽生[5]研究指出，骨骼肌萎縮中蛋白質(zhì)的分解速度顯著大于其合成速度。本研究建立骨骼肌萎縮模型，采用電針進(jìn)行干預(yù)，通過調(diào)控Akt/mTOR通路，研究其對骨骼肌萎縮作用機(jī)制，為臨床治療骨骼肌萎縮提供理論支持。

本研究結(jié)果顯示，電針組骨前肌濕重、干重、干重/體重高于模型組，低于假手術(shù)組，說明通過電針治療后，能改善大鼠骨前肌濕重、干重以及干重/體重。肌肉重新獲得神經(jīng)支配，肌肉萎縮速度變快，導(dǎo)致靶肌肉發(fā)生了不可逆的萎縮，肌細(xì)胞發(fā)生纖維化，其神經(jīng)不能進(jìn)行再支配[6-7]。電針組骨骼肌肌纖維直徑、面積高于模型組，低于假手術(shù)組，說明電針能延緩大鼠骨骼肌萎縮的程度，促進(jìn)其恢復(fù)。相關(guān)研究指出，電針對增齡性骨骼肌萎縮模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠腓腸肌濕重/體重增加，肌纖維平均橫截面積也隨之增加[8-9]。蘇艷紅等[10]研究也指出，采用后肢懸垂法建立骨骼肌萎縮模型，對其腓腸肌上端末梢進(jìn)行針刺，發(fā)現(xiàn)大鼠比目魚肌濕重/體重比值增加，其橫截面積擴(kuò)大。

骨骼肌是機(jī)體中重要的運(yùn)動器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，機(jī)體中多種活性多肽以及細(xì)胞因子均通過骨骼肌分泌和合成，對骨骼肌糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝發(fā)揮調(diào)控作用[11-12]。MuRF1屬于一種泛素蛋白連接酶，在骨骼肌和心肌中表達(dá)，泛素蛋白酶有多個調(diào)節(jié)點(diǎn)，影響因素較多，在骨骼肌萎縮過程中發(fā)揮著重要作用[13]。在骨骼肌萎縮模型研究中，MuRF1 mRNA表達(dá)水平較高，在代謝發(fā)生之前，是診斷早期骨骼肌萎縮的重要指標(biāo)[14]。本研究顯示，模型組大鼠MuRF1蛋白表達(dá)較高，本研究與其保持一致。MuRF1具有泛素連接酶活性作用，其表達(dá)上調(diào)會導(dǎo)致粗絲連接蛋白發(fā)生斷裂甚至水解，通過降解肌纖維蛋白，導(dǎo)致骨骼肌萎縮，發(fā)生病變[15]。本研究結(jié)果顯示，電針組骨骼肌相關(guān)蛋白MURF1表達(dá)低于模型組，說明電針干預(yù)能下調(diào)MURF1表達(dá)。FNDC5屬于一種肽類激素蛋白主要通過肌肉分泌。PGC-1α屬于一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子，F(xiàn)NDC5是其主要的依賴性肌肉因子[16]。PGC-1α參與線粒體生成、能量代謝以及肌纖維類型轉(zhuǎn)化過程。相關(guān)研究指出，PGC-1α對骨骼肌中的FNDC5有促進(jìn)作用，通過外部的應(yīng)激刺激對骨骼肌中的PGC-1α、FNDC5表達(dá)有誘導(dǎo)作用，通過斷裂能促進(jìn)肌肉因子Irisin形成[17-18]。本研究顯示，電針組PGC-1α、FNDC5表達(dá)高于模型組，說明電針能上調(diào)PGC-1α、FNDC5表達(dá)，從而調(diào)控大鼠骨骼肌萎縮情況。

mTOR屬于雷帕霉素靶蛋白，Akt可以直接作用于mTOR，因此mTOR是Akt下游的一種底物，發(fā)揮著重要作用。研究指出，mTOR是Akt下游的重要靶點(diǎn)，可以被磷酸化Akt激活，調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞生長主要是通過下游靶物來完成，促進(jìn)其增殖，有助于相關(guān)蛋白質(zhì)合成，起到延緩骨骼肌萎縮的作用[19-20]。本研究結(jié)果證實(shí)，電針組Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR表達(dá)升高，說明電針能將Akt/mTOR信號通路激活。通過本研究進(jìn)行分析，電針能有效控制失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的速度，通過調(diào)控Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)肌蛋白分解和合成，抑制肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化，參與神經(jīng)肌接頭傳導(dǎo)，促進(jìn)其肌細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)換,因此電針可治療骨骼肌萎縮。

綜上所述，電針對骨骼肌萎縮模型大鼠干預(yù)效果顯著，能改善大鼠骨骼肌萎縮狀況，通過激活A(yù)kt/mTOR通路，調(diào)控骨骼肌相關(guān)蛋白MURF1、PGC-1α和FNDC5表達(dá)，從而抑制骨骼肌萎縮。