王文秀,邱連利,劉 倩,丁凡帆,康曉文

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

腦卒中因高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率成為我國居民的主要死亡原因，而其中的缺血性腦血管類疾病又占全部腦血管疾病總數(shù)的60%～80%[1]，而細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecules-1,ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMPs-9)在腦水腫發(fā)生中的作用逐漸受到重視，主要體現(xiàn)于腦出血后炎癥反應(yīng)方面：當(dāng)腦組織發(fā)生損傷時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞隨之受損，通透性進(jìn)而增加并產(chǎn)生凝血活性物質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)為促凝狀態(tài)，最終誘發(fā)血管出血及血栓，刺激ICAM-1、MMPs-9等炎癥因子異常增高[2]，使血管舒縮活性物質(zhì)不能正常表達(dá)，致使血管異常收縮，使腦缺血和卒中危險(xiǎn)系數(shù)增大。對(duì)于缺血性腦受損來說，選擇針灸方案進(jìn)行醫(yī)治存在著多路徑、多成效、多靶點(diǎn)維護(hù)及干預(yù)的特征，能夠限制局部病灶的擴(kuò)散范圍、促進(jìn)腦組織循環(huán)及腦組織氧代謝、提離腦血流量與腦部對(duì)缺氧的可耐受程度。石學(xué)敏[3]醫(yī)治中風(fēng)3 207例,初次發(fā)病2 523例,治愈1 489例,治愈率達(dá)59.%,總有效率98.97%,而多次發(fā)病者684例,治愈322例,治愈率47.07%,總有效率為96.64%。因而可見,越是初期利用醒腦開竅針法治療,其療效就越明顯;若是醒法治療介入時(shí)機(jī)越晩,則中風(fēng)病的致殘率就越高。有研究[4]發(fā)現(xiàn)治療后針灸治療組神經(jīng)功能缺損改善情況明顯優(yōu)于西醫(yī)常規(guī)治療組,并具備惡化率低的優(yōu)勢(shì)。針刺治療因副作用小、效果顯著、癥狀恢復(fù)穩(wěn)定而愈來愈被普遍地應(yīng)用到腦卒中后的醫(yī)治體系中。本實(shí)驗(yàn)采用“醒腦開竅”針法，探討“醒腦開竅”針法對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠不同時(shí)相間ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠144只,SPF級(jí)，來源：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，體質(zhì)量(280±20)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[甘]2015-0002；實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào)SYXK[甘]2015-0005。隨機(jī)分為：腦缺血再灌注損傷模型組(對(duì)照組)、醒神開竅針法組(實(shí)驗(yàn)組)，再按照灌注4 h、缺血1 d、7 d、20 d各分為4個(gè)亞組，每組18只大鼠。

1.2 造模方法

采用由Longa等[5]改進(jìn)的大腦中動(dòng)脈二次線栓法。大鼠稱體質(zhì)量，按3.3 mL∶100 g藥鼠比例,腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，待折屈大鼠尾部無反應(yīng)即為麻醉成功，麻醉后仰臥固定于大鼠板上頸部剃毛，碘伏消毒后偏頸部右側(cè)做一切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，此時(shí)可張開直鑷擴(kuò)大分離，在CCA近心端掛線備用，鈍性分離頸外動(dòng)脈(ECA)直至距離其與頸內(nèi)分叉處遠(yuǎn)心端1 cm處，分離并掛線結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，在近分叉處縫合掛線備用。鈍性分離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和ICA的顱外分支-翼腭動(dòng)脈。將ICA、CCA遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉，在距離分叉處遠(yuǎn)心端0.5 cm處將ECA用眼科剪剪一小口，插入碳素魚線，減去多余縫合線，縫合皮膚,同時(shí)予青霉素鈉肌注。造模后大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為1～3分者,且處死后取腦可見大鼠腦梗塞灶位于缺血顳葉,此為大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域,代表實(shí)驗(yàn)大鼠造模成功。

1.3 針刺方法

選用“醒腦開竅”針刺法之主穴雙“內(nèi)關(guān)”“人中”。選穴根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]《大鼠穴位圖譜的研制》[7],模擬人體腧穴骨度分寸法量取兩穴。大鼠不麻醉，仰臥，大鼠腹部套封在塑制100 mL氯化鈉輸液瓶后固定，然后將四肢及頭部固定在大鼠架上，采用華佗牌0.30 mm×0.25 mm規(guī)格針，先刺內(nèi)關(guān)，并于兩內(nèi)關(guān)穴接電針治療儀，疏密波(頻率2 Hz)，刺激程度以雙上肢輕微抖動(dòng)為宜；人中穴留針10 min，內(nèi)關(guān)兩穴留針20 min。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)缺損行為體征與評(píng)分 采用Z-Longa法對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，每次評(píng)分3次，求其平均值。評(píng)為4分：意識(shí)昏迷或者不能行走；評(píng)為3分:重度神經(jīng)功能缺陷,向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；評(píng)為2分:中度神經(jīng)功能缺陷,向手術(shù)側(cè)的對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；評(píng)為1分：輕度神經(jīng)功能缺損,表現(xiàn)為不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪。

1.4.2 腦組織ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA的表達(dá) 取兩組大鼠的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將各組6只大鼠在相應(yīng)的時(shí)相點(diǎn)取材：用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，快速沿左側(cè)胸骨柄剪開肋骨，開胸暴露心臟，于右心耳剪開一小孔，迅速穿刺左心室，用50 mL注射器吸取37 ℃生理鹽水灌注(灌注壓為100 mmHg)，重復(fù)多次，致右心耳流出無色清亮液體，以清除血液中的染料，開顱取腦。對(duì)大腦(左側(cè))缺血組織進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法分析。Trizo(YESEN)試劑提取腦組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增(試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品)步驟取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，確認(rèn)得出數(shù)據(jù)的可信性。計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量F=2-△△ct，平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及P值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組大鼠術(shù)后即評(píng)定神經(jīng)功能缺損癥狀，再灌注4 h、1 d、7 d到20 d，分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸減少，可以推測(cè)隨時(shí)間的延長各組的神經(jīng)功能有所恢復(fù)，評(píng)分逐漸下降，但實(shí)驗(yàn)組下降明顯高于對(duì)照組，20 d兩者的評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。由此可知：針刺可以有效改善腦缺血再灌注損傷后大鼠局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2.2 各組大鼠ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表達(dá)比較

大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ICAM-1表達(dá)均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2，pcr溶解曲線及擴(kuò)增曲線分別見于圖1、圖2；大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)MMPs-9表達(dá)均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3，pcr溶解曲線及擴(kuò)增曲線分別見于圖3～4。

表2 兩組MCAO大鼠不同時(shí)相ICAM-1 mRNA表達(dá)

表3 兩組MCAO大鼠不同時(shí)相MMPs-9 mRNA表達(dá)

圖1 ICAM-1Real-time溶解曲線

圖2 ICAM-1Real-Time擴(kuò)增曲線

圖3 MMPs-9Real-time溶解曲線

圖4 MMPs-9Real-Time擴(kuò)增曲線

3 討論

經(jīng)過大量查閱文獻(xiàn)筆者選擇體質(zhì)量為(280±20)g的SD大鼠作為研究對(duì)象，原因如下：第一，體質(zhì)量過小(<250 g)的大鼠對(duì)于麻藥耐受性比較差，增加了死亡率，而且體質(zhì)量較小的大鼠血管也較細(xì)，導(dǎo)致碳素魚線難以插入；第二，體質(zhì)量過大(>300 g)的大鼠血管變異的可能性大大增加，會(huì)使手術(shù)難度增加；第三，體質(zhì)量>300 g的大鼠血管相應(yīng)要粗很多，MCA的血流不能被線栓充分阻斷，從而導(dǎo)致造模成功率下降。除此之外，性別對(duì)于該模型的影響不容小覷，筆者選擇雄性大鼠是由于已有研究表明[7]，雌激素對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用，且雌激素的分泌具有周期性，而目前的技術(shù)尚不能準(zhǔn)確計(jì)算雌激素水平，即實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素不可控，而雄激素的分泌周期并不顯著且對(duì)神經(jīng)生理指標(biāo)無太大影響。故體質(zhì)量為(280±20)g的雄性SD大鼠更適合MCAO模型的制備。在前期造模預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)盡管線栓已完全且順利插入，但并未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，對(duì)此類造模不成功的大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，是由于個(gè)別大鼠血管變異，需要插入線栓的深度與理論有一定的差距；另有大鼠在麻醉清醒時(shí)評(píng)分達(dá)3分,卻于次日或隔日死亡，解剖發(fā)現(xiàn)大鼠顱底可見血凝塊，推測(cè)由于線栓過程中手法太重，造成了蛛網(wǎng)膜下腔出血，因此在此實(shí)驗(yàn)過程中，不僅要明確實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，亦要對(duì)造模插線的手法及時(shí)間予以精確掌握。本實(shí)驗(yàn)之所以選用MMPs-9、ICAM-1兩個(gè)炎癥因子作為觀察指標(biāo)是因?yàn)榻陙?，隨著對(duì)腦缺血損傷機(jī)制的研究愈加深入，進(jìn)行的相關(guān)研究亦隨之表明，炎癥因子的產(chǎn)生和發(fā)生作用是腦缺血損傷時(shí)的重要病理環(huán)節(jié)，因炎癥因子會(huì)導(dǎo)致腦組織代謝異常，引起神經(jīng)元損傷和凋亡[8]。ICAM-1能夠在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，在炎性細(xì)胞因子以及內(nèi)毒素等物質(zhì)的刺激下表達(dá)率大幅度升高,當(dāng)腦發(fā)生損傷時(shí)，TNF-α mRNA的表達(dá)會(huì)增加,進(jìn)而對(duì)組織造成損傷，具體的機(jī)制：血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，通透性增加并產(chǎn)生凝血活性物質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為促凝狀態(tài)，最終誘發(fā)血管出血及血栓[9]；刺激ICAM-1異常增高,使血管舒縮活性物質(zhì)不能正常表達(dá)，致使血管異常收縮，進(jìn)一步使得腦缺血以及局部卒中的危險(xiǎn)系數(shù)增加；觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而MMPs來源于血管平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中，其中與腦缺血及再灌注密切相關(guān)的主要為明膠酶A(MMP-2)、明膠酶B(MMP-9)。這兩種MMPs被激活或活性上調(diào)，導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞，功能損傷，繼而引起腦水腫和出血[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注損傷后4 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA已大量表達(dá)，再灌注1 d時(shí)兩組大鼠的兩種炎癥因子表達(dá)到最高峰，7～20 d，隨時(shí)間的延長，兩組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)逐漸降低，且實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組(P<0.05)；再灌注20 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。因此，本實(shí)驗(yàn)證明，“醒腦開竅”針法可以通過抑制血清及腦組織中炎癥因子ICAM-1、MMPs-9的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用，并且針刺時(shí)間越早、周期越長，其療效也就越明顯。但在腦缺血損傷過程中，影響血腦屏障的因素很多，本實(shí)驗(yàn)中筆者所涉及檢測(cè)到的指標(biāo)有限，然而體內(nèi)微環(huán)境復(fù)雜，“醒腦開竅”針刺療法是否通過其他方式減輕腦損傷，這些問題都需要在后續(xù)的研究中以待完善。