崔桂玲, 宋 艷, 胡曰富, 齊慶蓉
(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院,四川 成都 610041)
肼作為一種化學(xué)物質(zhì),由于其堿性和還原性,使其在醫(yī)藥、化學(xué)、催化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用,同時(shí),肼也是一種高能量原料,所以也被應(yīng)用于航天領(lǐng)域,然而該物質(zhì)不僅有毒,還有致癌作用,微小量的泄露不僅會造成環(huán)境污染,也會對人體的肝、腎、肺、中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)等造成傷害[1-5],因此對于微量肼的檢測至關(guān)重要。
傳統(tǒng)的檢測肼的分析方法包括電化學(xué)分析法、色譜法和分光光度法,但這些分析方法不僅復(fù)雜耗時(shí),而且靈敏度低[6-9]。相比于傳統(tǒng)的肼檢測方法,熒光分析法具有高靈敏性、高選擇性、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)[10-12],因此更受歡迎。文獻(xiàn)報(bào)道的主要檢測肼的基團(tuán)有乙?;?-溴丁酸酯、乙酰丙酸鹽、鄰苯二甲酰亞胺、醛、丙二腈等,
Scheme 1
但大部分探針的最大紫外吸收和發(fā)射均位于紫外可見光區(qū),不適合生物成像。因近紅外區(qū)的光具有較低的背景熒光,較低的光毒性和較深的穿透性[13-14],所以近紅外熒光探針更具有應(yīng)用價(jià)值。
2016年,Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)了用乙酸酯作為識別位點(diǎn)的檢測肼的近紅外探針,2018年,Lu等[15]報(bào)道了用溴丁酸酯作為識別基團(tuán)的檢測肼的近紅外探針,這類探針通過一個(gè)可以調(diào)控的羥基使探針及檢測肼后產(chǎn)物的最大發(fā)射波長均位于近紅外區(qū),具有明顯的降低自熒光、低毒性、深度滲透等優(yōu)點(diǎn),但兩者最大發(fā)射波長很接近,難以觀察到探針和產(chǎn)物各自熒光變化的線性。2012年,Lin等[16]報(bào)道在半花菁類分子(Chart 1)羥基的鄰位引入氯原子可以改變半花菁分子的部分光學(xué)性質(zhì),但類似報(bào)道很少。鑒于此本文設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)新型的檢測肼的熒光探針,并對其進(jìn)行了光譜分析,研究其對肼的選擇性。以2,3,3-三甲基-3H-吲哚與正丙基溴為原料反應(yīng)合成2,3,3-三甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽2,繼而與2-氯-3-羥次甲基環(huán)己烯醛縮合生成2- (2-(2-氯-3-((3,3-二甲基-1-丙基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞烷基)亞乙基)-1-環(huán)己烯-1-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽3,再與4-乙基間苯二酚在三乙胺催化下反應(yīng)生成2-(2-(7-乙基-6-羥基-2,3-二氫-1H-呫噸-4-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽4,最后與乙酰氯經(jīng)成酯反應(yīng)生成半菁類探針2-(2-(7-乙基-6-乙酰氧基-2,3-二氫-1H-呫噸-4-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽5(Chart 2),探針結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H NMR、13C NMR和HR-MS(ESI)表征。
UV-2450型紫外可見分光光度計(jì);Varian-Unity 400 MHz型核磁共振儀;Waters Q-TOF-Premier型質(zhì)譜儀;Varian Cary Eclipse Fluoromete型熒光光譜儀。
Chart 1
Chart 2
其余所用試劑均為分析純。
(1)1的合成[17-18]
在干燥的500 mL三頸瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺37.2 g(0.5 mol)和二氯甲烷50 mL, 0 ℃下依次滴加三氯氧磷62.5 g(0.4 mol),環(huán)己酮10.0 g(0.1 mol), 80 ℃回流4 h;減壓蒸除溶劑,冷卻至室溫后傾至冰水中,析出大量黃色固體,抽濾,濾餅用冰水洗滌3次,真空干燥,丙酮重結(jié)晶后得黃色固體19.0 g,收率51%, m.p.127~128 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 10.84(s, 1H, CHO), 2.53~2.47(m, 1H, CH), 2.36(t,J=6.1 Hz, 4H, CH2), 1.58(p,J=6.3 Hz, 2H, CH2)。
(2)2的合成[17-19]
在干燥的250 mL三頸瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚5.0 g(31.5 mmol)、正丙基溴4.7 g(38.1 mmol)和鄰二氯苯15 mL,110 ℃攪拌12 h(TLC檢測)。冷卻至室溫,傾倒入100 mL異丙醚中,大量粘性固體析出,靜置,傾倒出上清液,加少量丙酮并攪拌,大量固體析出,抽濾,濾餅用異丙醚洗滌三次,得棕紅色固體產(chǎn)物24.5 g。該產(chǎn)品不經(jīng)純化直接用于下一步。
(3)3的合成[17-18]
在干燥的100 mL三頸瓶中加入24.5 g(6.0 mmol)、11.9 g(11.0 mmol)、乙酸鈉1.8 g(22.2 mmol)和乙酸酐8 mL,于室溫?cái)嚢? h,(TLC檢測)。加100 mL異丙醚,有大量綠色固體析出,抽濾,濾餅用異丙醚洗滌,得綠色固體產(chǎn)物36.9 g。該產(chǎn)品不經(jīng)純化直接用于下一步。
(4)4的合成[17]
在干燥的100 mL三頸瓶中加入3300.0 mg(49.6 mmol)、 4-乙基間苯二酚100.0 mg (72.4 mmol)、三乙胺270.0 mg(2668.2 mmol)和乙腈8 mL,回流5 h(TLC檢測)。冷卻至室溫,減壓蒸除溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:二氯甲烷/甲醇=100/1~30/1,V/V)純化得青綠色固體4170.0 mg,收率68%;1H NMR(Methanol-d4, 400 MHz)δ: 8.15(d,J=13.4 Hz, 1H, CH=CH), 7.56(s, 1H, ArH), 7.30(d,J=7.4 Hz, 1H, ArH), 7.20(t,J=7.7 Hz, 1H, ArH), 7.17(s, 1H, ArH), 6.99(t,J=7.3 Hz, 1H, ArH), 6.95(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 6.41(s, 1H, CH), 5.76(d,J=13.5 Hz, 1H, CH=CH), 3.82(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 2.66(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.57(t,J=6.7 Hz, 2H, CH2), 2.52(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 1.82(p,J=6.3 Hz, 2H, CH2), 1.72(p,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 1.61(s, 6H, CH3), 1.13(t,J=7.5 Hz, 3H, CH3), 0.94(t,J=7.4 Hz, 3H, CH3); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C30H34NO2Br{[M-Br]+}440.2584, found 440.2578。
(5)5的合成[15-16]
在干燥的25 mL單頸瓶中加入421.9 mg(42.2 nmol)、三乙胺60.0 mg(59.3 nmol)和二氯甲烷25 mL,于冰鹽浴中攪拌,緩慢滴加乙酰氯110.0 mg(1.4 mmol)的二氯甲烷溶液2 mL,滴畢,室溫?cái)嚢? h(TLC檢測)。減壓蒸除溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:二氯甲烷/甲醇=100/1~30/1,V/V)純化得青綠色固體5150.0 mg,收率93%;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.61(d,J=14.9 Hz, 1H, CH=CH), 7.55~7.37 (m, 4H, ArH), 7.27(s, 1H, ArH), 7.15(s, 1H, ArH), 7.04(s, 1H, CH), 6.70(d,J=14.8 Hz, 1H, CH=CH), 4.58(t,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 2.80(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.74(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.58(q,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.39(s, 3H, CH3), 2.08~1.87(m, 4H, CH2), 1.79(s, 6H, CH3), 1.21(t,J=7.5 Hz, 3H, CH3), 1.08(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 178.30, 169.14, 160.27, 151.26, 150.81, 146.14, 142.00, 141.45, 133.86, 131.58, 130.17, 129.34, 127.76, 127.56, 122.52, 119.96, 115.40, 113.36, 109.96, 105.98, 50.91, 47.81, 29.49, 28.24, 24.56, 22.80, 21.59, 21.00, 20.26, 13.97, 11.59; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C32H36NO3Br{[M-Br]+}482.2690, found 482.2693。
用15% DMSO PBS溶液(pH=7.4)分別配制20 μmol/L的探針5標(biāo)準(zhǔn)溶液和2000 μmol/L的肼溶液,兩者等體積混合后,在避光條件下,每三分鐘取樣進(jìn)行紫外掃描。由圖1a可知,探針5的最大紫外吸收波長為598 nm,與肼反應(yīng)后生成的產(chǎn)物最大紫外吸收波長為702 nm;由圖1b可知,探針與肼反應(yīng)60 min內(nèi),探針最大紫外吸收值逐漸降低,產(chǎn)物最大紫外吸收值逐漸升高,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,598 nm處的最大紫外吸收值逐漸降低,702 nm處的最大紫外吸收值逐漸升高,且加肼前后混合液的顏色變化明顯,加肼之前為藍(lán)色,加肼反應(yīng)之后為青綠色,表明探針5能夠檢測肼;由圖1c可以看出,探針與肼的反應(yīng)時(shí)間隨著肼濃度的增大而加快。與肼反應(yīng)之前,探針5的羥基是以乙酸酯的形式存在,羥基氧原子給電子能力降低,最大紫外吸收波長較低,當(dāng)與肼反應(yīng)之后,產(chǎn)物主要以氧負(fù)離子的形式存在,氧原子給電子能力增強(qiáng),故最大紫外吸收波長紅移[16]。
用DMSO配制濃度為640 μmol/L探針標(biāo)準(zhǔn)溶液,用15%DMSO的PBS緩沖溶液(pH=7.4) 將探針5標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成20 μmol/L,分別與不同濃度的肼等體積混合反應(yīng),得到熒光發(fā)射光譜(圖2c)。用598 nm進(jìn)行激發(fā),可得到探針5的最大發(fā)射波長為666 nm,與肼反應(yīng)之后,產(chǎn)物最大發(fā)射波長位于723 nm處(圖2a),且產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長大幅度增加,探針的熒光強(qiáng)度緩慢減小(圖2b)。
λ/nm
λ/nm
t/min
λ/nm
λ/nm
λ/nm圖2探針5的熒光發(fā)射光譜(a: 加肼前后的變化情況; b: 探針與不同濃度肼混合后在666 nm和723 nm處的熒光強(qiáng)度變化情況; c: 探針對不同濃度肼的熒光強(qiáng)度變化)
根據(jù)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理(PET),當(dāng)探針5的識別基團(tuán)乙?;幱谧杂蓱B(tài)時(shí),其HOMO軌道上的電子可以向熒光團(tuán)的HOMO轉(zhuǎn)移,致使熒光團(tuán)被激發(fā)到LOMO軌道上的激發(fā)態(tài)電子不能返回基態(tài)產(chǎn)生熒光或熒光很弱,而乙?;c肼結(jié)合之后,乙?;腍OMO上的電子無法轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)的HOMO軌道上,使PET過程無法進(jìn)行,這時(shí)熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)產(chǎn)生熒光,故產(chǎn)物熒光遠(yuǎn)強(qiáng)于探針[20]。
選擇性是評價(jià)探針的重要指標(biāo)之一,因此本實(shí)驗(yàn)研究了探針5對可能的常見干擾物質(zhì) (2-羥基乙基胺、 KCl、 Na2SO4、 CaCl2、 MgSO4、 CuSO4、 ZnSO4、 FeCl3、 FeSO4、 NaBr、 CH3COONa、 K2CO3、 NaH2PO4、 NH4Cl、 NH3.H2O、二乙胺、尿素、硫脲、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、異煙肼和乙酰肼)的響應(yīng)情況,分別向濃度為20 μmol/L的探針標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入等體積的2000 μmol/L的待測物質(zhì)溶液,室溫避光放置48 min后,依次取樣進(jìn)行熒光掃描,結(jié)果表明,該探針5對上述物質(zhì)無明顯響應(yīng),對肼具有良好的選擇性。
本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)可用于檢測肼的近紅外小分子熒光探針,通過可調(diào)控基團(tuán)羥基,使探針5在與肼反應(yīng)前后共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起熒光強(qiáng)度的變化。探針5最大紫外吸收波長為598 nm,最大熒光發(fā)射波長為666 nm,與肼反應(yīng)后的產(chǎn)物最大紫外吸收波長為702 nm,最大熒光發(fā)射波長為723 nm,當(dāng)肼的濃度在0~1000 μmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度與濃度具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.9919,檢測限為2.93 μmol/L。同時(shí),該探針的最大發(fā)射波長位于近紅外,有利于克服生物體自身熒光的干擾,有望成為一種理想的檢測肼的熒光探針。