吉燕華, 楊清泉, 郭奇峰, 陳金林, 張卓成, 李 昊, 曾治君,1b*

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) a. 中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心； b. 江西省中醫(yī)病因?qū)W重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，含有氨基和羧基，作為構(gòu)成人體最基本的物質(zhì)之一，對(duì)機(jī)體有著重要作用，因此，在醫(yī)療領(lǐng)域特別重視氨基酸的價(jià)值。在臨床上，主要用于制備復(fù)方氨基酸輸液，維持患者的營(yíng)養(yǎng)，在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中占據(jù)著重要的地位[1-3]。同時(shí)，一些氨基酸因其特定的生理功能，對(duì)肝病[4]、消化道疾病[5-6]以及心血管疾病[7]等都有著較好的療效。

酪氨酸是人體非必需氨基酸，可以促進(jìn)黑色素的生成[8]、用于營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、緩解抑郁癥[9-10]等。而酪氨酸可合成更復(fù)雜的分子，具有一定的抗腫瘤活性。Vasconcelos等[11]通過超聲化學(xué)反應(yīng)合成了Tyr-Tyr二肽，發(fā)現(xiàn)部分二肽對(duì)低濃度白血病細(xì)胞有活性，降低了其生存能力，但對(duì)非腫瘤細(xì)胞無活性，說明其對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性的細(xì)胞毒性。

鈷是一種過渡金屬，可用于蓄電池、催化劑[12]等，又因其具有一定的韌性、抗腐蝕性[13]，是心血管支架等植入體的關(guān)鍵原料之一[14]。鈷同時(shí)也是維生素B12的組成部分，在醫(yī)學(xué)上，鈷也有著一定的抗腫瘤活性[15]，但鈷本身有著一定的毒性，對(duì)人體的健康有影響[16]。鈷與氨基酸形成的配合物在減小鈷元素的毒性的同時(shí)，還能提高抗腫瘤活性[15]。鑒于氨基酸配合物的特點(diǎn)，本文以酪氨酸和乙酸鈷四水為原料合成酪氨酸-鈷配合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、 TG、 SEM和EDS確證，通過CCK-8比色法測(cè)定了配合物對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)的抗腫瘤活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Quant 250FEG型掃描電子顯微鏡與透射電子顯微鏡；ESXTAR6000 TG-DTA型熱重分析儀；Nicolet iS5型紅外光譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

稱取D-酪氨酸0.3 mmol和四水合乙酸鈷0.1 mmol 于溶解于10 mL無水乙醇中，室溫下攪拌15 min后密封置于160 ℃的烘箱中反應(yīng)24 h，在逐漸降至室溫。反應(yīng)完畢后，依次用水，乙醇洗滌3次，置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥后得褐色粉末狀酪氨酸鈷配合物。

1.3 體外細(xì)胞毒性檢測(cè)

使用標(biāo)準(zhǔn)的CCK-8分析程序?qū)⑻幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞置于96孔微分析培養(yǎng)板(每孔10000個(gè)細(xì)胞)中，在溫度37 ℃、 5%CO2的條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。定量稱取配合物后溶解稀釋，分別配成濃度為1.41、 2.81、 5.63、 11.25、 22.50、 45.00和90.00 μg·mL-1的溶液。設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零組。在37 ℃， 5%CO2中孵育48 h。孵育完成后，將上液吸去，避光條件下加入新配制檢測(cè)液(90%培養(yǎng)液和10%CCK-8試劑)。2 h后，用450 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔的光密度，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次后取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征分析

(1) SEM

將樣品置于瑪瑙研缽中研磨，待成粉末后噴金30 s，并置于掃描電鏡下觀察。圖1為掃描電鏡SEM圖片。觀察圖1中a、 b和c可以發(fā)現(xiàn)，樣品有固定的幾何形狀(球形)，并且大小均勻。

圖1樣品的SEM照片

(2) IR

圖2為酪氨酸和合成配合物的IR譜圖。從圖2配合物與酪氨酸的曲線可以看到，配合物的紅外光譜在1900～1650 cm-1處峰減弱，表明酪氨酸形成了配合物，限制了鍵的自由振動(dòng)。在3300～2500 cm-1處峰消失，表明酪氨酸羧基中的氫氧鍵在形成配合物時(shí)斷裂。對(duì)比圖2中酪氨酸與配合物在1598 cm-1處的吸收峰，可發(fā)現(xiàn)配合物在此處的吸收峰強(qiáng)度降低，因此推測(cè)金屬離子鈷與羧基發(fā)生配位降低了鍵強(qiáng)度；對(duì)比1250 cm-1處的峰可知碳氮單鍵強(qiáng)度減弱，由此推測(cè)金屬離子鈷與酪氨酸中的羧基和氨基發(fā)生了配位[17]。

ν/cm-1

(3) 元素分析

借助電鏡能譜分析，得到配合物的元素含量分布(圖3)。 a為配合物掃描電鏡圖，b為各元素在配合物中的總體分布情況，c為碳元素分布，d為氧元素分布，e為鈷元素分布，f為氮元素分布。由此看出所合成的配合物中有C、 N、 O和Co等元素。

表1 配合物對(duì)A549細(xì)胞抑制率

圖3 配合物的元素分布

(4) TG

從圖4可以看出，鈷(Ⅱ)配合物經(jīng)歷了兩個(gè)階段的分解。第一個(gè)分解階段(25～100 ℃)，估計(jì)重量損失7.1% ，可能是由于消除了一個(gè)水分子。且失水溫度不高，推測(cè)水以吸附的形式存在[18]。第二個(gè)分解階段(200～450 ℃)， TG曲線發(fā)生劇烈變化，是由氨基酸配合物骨架斷裂、分解引起的[19]。最終TG曲線區(qū)域平緩，剩余重量為28.6%，分解產(chǎn)物為鈷的氧化物。

Temperature/℃

結(jié)合IR認(rèn)為，鈷離子與酪氨酸中的羧基和氨基發(fā)生配位，可以確定配合物中酪氨酸與鈷配合物的摩爾比為1/1，根據(jù)TG曲線中第一階段的失重比，得到分子式為C9H9NO2·Co·H2O。

2.2 抗腫瘤活性

表1是配合物在濃度為1.41、 2.81、 5.63、 11.25、 22.50、 45.00和90.00 μg·mL-1時(shí)對(duì)A549的抑制率。由表1可以看出，總體趨勢(shì)上，隨著配合物濃度的增加，配合物的抗腫瘤活性也隨之增加。在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，配合物對(duì)A549的抑制率整體呈上升趨勢(shì)，在濃度為90 μg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到25.19%。因此，可以得出目標(biāo)配合物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株有一定的活性。

以酪氨酸為有機(jī)配體合成了新型二價(jià)鈷配合物，利用細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)對(duì)A549細(xì)胞株進(jìn)行抗癌活性檢測(cè)。初步體外活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該配合物對(duì)肺癌A549細(xì)胞株有一定的抗腫瘤活性。