趙雙 謝凱 郭煜 譚嘉 吳鈞翔 楊陽(yáng)子 王磊 姜聞博 郝永強(qiáng)

骨缺損修復(fù)一直是臨床的重大挑戰(zhàn)，目前常用的移植骨或填充材料面臨來源有限、與缺損部位不匹配、成骨活性低以及感染風(fēng)險(xiǎn)等問題。理想的骨修復(fù)材料應(yīng)具有個(gè)性化設(shè)計(jì)的外形，并且可以降低細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。隨著骨組織工程技術(shù)和3D打印技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)兼具個(gè)性化外觀和生物功能的骨修復(fù)支架成為新的研究熱點(diǎn)。

聚己內(nèi)酯(PCL)作為人工高分子材料，因具有良好的生物相容性和可降解性，已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域[3]。但是，單純PCL表面疏水且生物學(xué)活性不足，難以滿足骨植入需求[4]。因此，有必要對(duì)PCL進(jìn)行改性，賦予其生物學(xué)功能。

銅是細(xì)胞生長(zhǎng)的必需微量元素，作為一種輔助因子或活化劑參與細(xì)胞代謝的許多方面，具有多種生物學(xué)功能，尤其在骨形成和抗菌等方面具有獨(dú)特作用[5-6]?；煦~或銅涂層材料雖有良好的成骨性和抗菌性，但可能導(dǎo)致大量Cu2+或微小銅顆粒釋放，在局部引起嚴(yán)重而持久的異物反應(yīng)[7]。因此，將銅的氧化物混入復(fù)合材料中，是研究和利用銅的生物學(xué)功能的重要方式。

本研究擬通過熔融共混法將0%、5%、10%的CuO粉末混入PCL基材中，用熔融沉積方法(FDM)3D打印方式制作個(gè)性化多孔支架，初步探索PCL/CuO復(fù)合材料的促成骨和抗菌性能，為含銅骨修復(fù)支架的研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

PCL(無(wú)錫沙欣納新材料科技有限公司)，CuO粉末、茜素紅染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液、α-基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(美國(guó)Cyagen公司)，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ALP染色試劑盒(上海虹橋醫(yī)用試劑實(shí)驗(yàn)研究所)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)，PCR相關(guān)試劑盒(日本TaKaRa公司)，細(xì)菌活死染色試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，劃痕實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿插件(德國(guó)Ibidi公司)。

混料機(jī)XSS-300轉(zhuǎn)矩流變儀(上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司)，F(xiàn)DM打印機(jī)(杭州捷諾飛生物科技股份有限公司)，PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，ICP離子濃度檢測(cè)儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 PCL/CuO復(fù)合材料及支架制備

通過混料機(jī)將0%、5%、10%的CuO分別與PCL充分混合后制備PCL/CuO復(fù)合材料(PCL、PCL/5%CuO和PCL/10%CuO)，根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的支架規(guī)格(圓片狀，直徑8 mm，高度1.5 mm，絲徑300 μm，絲距400 μm，夾角60 °)，使用FDM打印機(jī)制備多孔支架(圖1)。打印機(jī)的具體參數(shù)：溫度90 ℃，氣壓0.6 MPa，速度6～8 mm/s。

a-c：設(shè)計(jì)圖；d：PCL；e：PCL/5%CuO；f：PCL/10%CuOa-c: schematic diagrams; d: PCL; e: PCL/5%CuO; f: PCL/10%CuO圖1 支架設(shè)計(jì)和實(shí)物Fig. 1 Schematic diagrams and photographs of the different scaffolds

1.3 浸提液制備及Cu2+釋放實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后的PCL、PCL/5%CuO、PCL/10%CuO多孔支架依據(jù)ISO 10993-12標(biāo)準(zhǔn)按0.1 g/mL的比例浸泡于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置入37 ℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，72 h后收集浸提液于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將支架按上述比例浸泡于培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱中，在第1、2、3、5、7、14天時(shí)用ICP離子濃度檢測(cè)儀檢測(cè)培養(yǎng)基中累積的Cu2+濃度。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將環(huán)氧乙烷滅菌后的3組支架各3枚置于24孔板中，每孔加入1 mL的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)懸液，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。支架和細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、5、7 h 后，用PBS沖洗后將支架移入新的24孔板中，每孔中加入500 μL的CCK-8工作液(培養(yǎng)基與CCK-8液體積比為10∶1)，培養(yǎng)箱中孵育1 h后，每孔吸取100 μL工作液至相應(yīng)的96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在波長(zhǎng)450 nm處的光密度值(OD值)。

1.4.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將rBMSCs以5 000個(gè)/孔接種于96孔板，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞完全貼壁后，將各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液更換為相應(yīng)的浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)。在第1、3、5、7天時(shí)采用CCK-8法檢測(cè)各組在波長(zhǎng)450 nm處的OD值，方法同1.4.1。

1.4.3細(xì)胞成骨分化實(shí)驗(yàn)

將rBMSCs與各組浸提液共培養(yǎng)并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過ALP染色及活性測(cè)定、茜素紅染色及半定量分析、PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討PCL組、PCL/5%CuO組、PCL/10%CuO組支架浸提液對(duì)rBMSCs成骨分化的影響。向各組浸提液中加入100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL抗壞血酸鹽，組成各組成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

1.4.3.1ALP染色及活性測(cè)定

將rBMSCs按5×104個(gè)/L的數(shù)量接種于24孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后行ALP染色并拍照，按試劑盒說明書行ALP活性定量分析[8]。

1.4.3.2茜素紅染色及半定量分析

參照1.4.3.1方法對(duì)rBMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，21 d后行茜素紅染色并拍照，孔板內(nèi)的固態(tài)顆粒即礦化結(jié)節(jié)，再加入氯化十六烷基吡啶溶液充分溶解該結(jié)節(jié)，檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)620 nm處的OD值[8]。

1.4.3.3PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)

將rBMSCs按2×105個(gè)/L的數(shù)量接種于6孔板中，rBMSCs成骨誘導(dǎo)方法同1.4.3.1。培養(yǎng)第7天時(shí)，用Takara試劑盒提取各孔總RNA，按照試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄PCR分析。檢測(cè)的成骨相關(guān)基因?yàn)棰裥湍z原(Col-1)、ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、骨橋蛋白(OPN)[8]，GAPDH設(shè)為內(nèi)參(表1)。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.4.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將70 μL的rBMSCs懸液加入Ibidi培養(yǎng)插件內(nèi)，細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/mL，鏡下觀察細(xì)胞已經(jīng)全部貼壁后，超凈臺(tái)中小心移除插件，再用顯微鏡檢查“劃痕”，初始的劃痕寬度為500 μm。加入1 mL對(duì)應(yīng)的浸提液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，4%多聚甲醛固定，PBS清洗后鏡下觀察遷移效果并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量寬度。

1.5 抗菌實(shí)驗(yàn)

1.5.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌液的制備

取MRSA的新鮮培養(yǎng)物于大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，得到細(xì)菌原液，再用各組支架浸提液稀釋至1×106CFU/mL的細(xì)菌懸液備用，單純TSB設(shè)為對(duì)照(TSB組)。

1.5.2浸提液抑菌實(shí)驗(yàn)

將細(xì)菌懸液按每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)，TSB組為對(duì)照組，每組3孔，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中，于1、2、3、4、5、6、9、12 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)600 nm處的OD值。

1.5.3抗生物膜形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)菌懸液按每孔500 μL接種于24孔板內(nèi)，TSB組為對(duì)照組，每組3孔，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中，于1、3、6 h后行細(xì)菌活死細(xì)胞染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌生物膜形成情況[9]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8及SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+釋放實(shí)驗(yàn)

根據(jù)支架材料在完全培養(yǎng)基內(nèi)模擬體內(nèi)環(huán)境所進(jìn)行的釋放實(shí)驗(yàn)，隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，PCL/5%CuO組、PCL/10%CuO組復(fù)合材料均可緩慢釋放Cu2+(圖2)。

圖2 支架體外降解：不同時(shí)間點(diǎn)的累積Cu2+濃度Fig. 2 In vitro degradation of scaffolds: cumulative Cu2+ concentrations at different time points

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8法評(píng)估rBMSCs在不同時(shí)間點(diǎn)與支架的黏附情況。結(jié)果(圖3a)顯示，在早期(5 h以內(nèi))，各組OD值均有升高趨勢(shì)，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在7 h時(shí)，相較于PCL組，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組細(xì)胞黏附增加(P<0.05)，但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8法評(píng)估rBMSCs在各組浸提液里的增殖情況。結(jié)果(圖3b)顯示，培養(yǎng)3 d時(shí)，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組的OD值均較PCL組升高(P<0.05)，但PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組的OD值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。培養(yǎng)7 d時(shí)，PCL/10%CuO組OD值較其他兩組高(P<0.05)。

*： 與PCL組相比，P<0.05； #： 與PCL/5%CuO組相比，P<0.05；ns:P>0.05*: compared with PCL group, P<0.05; #: compared with PCL/5%CuO group, P<0.05；ns: P>0.05圖3 CCK-8法檢測(cè)rBMSCs的黏附(a)和增殖(b)Fig. 3 Cell adhesion (a) and proliferation (b) of rBMSCs detected by CCK-8

2.2.3細(xì)胞成骨分化實(shí)驗(yàn)

2.2.3.1ALP染色及活性測(cè)定

浸提液成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組ALP染色均顯著強(qiáng)于PCL組，且PCL/10%CuO組強(qiáng)于PCL/5%CuO組(圖4a)。ALP活性測(cè)試表明，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組ALP活性明顯高于PCL組(P<0.05)，PCL/10%CuO組高于PCL/5%CuO組(P<0.05，圖4b)。

2.2.3.2茜素紅染色及半定量分析

浸提液成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d時(shí)，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組茜素紅染色均顯著強(qiáng)于PCL組，且PCL/10%CuO組強(qiáng)于PCL/5%CuO組(圖5a)。鈣結(jié)節(jié)半定量分析表明，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組OD值均明顯高于PCL組(P<0.05)，PCL/10%CuO組高于PCL/5%CuO組(P<0.05，圖5b)。

*： 與PCL組相比，P<0.05； #： 與PCL/5%CuO組相比，P<0.05*: compared with PCL group, P<0.05; #: compared with PCL/5%CuO group, P<0.05圖4 ALP染色(a)及定量分析(b)Fig. 4 ALP staining (a) and quantitative analysis (b)

2.2.3.3PCR檢測(cè)結(jié)果

使用PCR對(duì)rBMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示，與PCL組相比，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組浸提液的Col-1、ALP、Runx2和OPN的mRNA表達(dá)水平均有顯著提高(P<0.05)，且PCL/10%CuO組Col-1表達(dá)水平高于PCL/5%CuO組(P<0.05)。

2.2.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

如圖7、8所示，rBMSCs與各組支架浸提液培養(yǎng)6 h以后，相比PCL組，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組遷移寬度均變小(P<0.05)，但PCL/5%CuO 組和PCL/10%CuO組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

*： 與PCL組相比，P<0.05； #： 與PCL/5%CuO組相比，P<0.05*: compared with PCL group, P<0.05; #: compared with PCL/5%CuO group, P<0.05圖5 茜素紅染色(a)及半定量分析(b)Fig. 5 Alizarin red staining (a) and semi-quantitative analysis (b)

*： 與PCL組相比，P<0.05； #： 與PCL/5%CuO組相比，P<0.05; ns:P>0.05*: compared with PCL group, P<0.05; #: compared with PCL/5%CuO group, P<0.05; ns:P>0.05圖6 成骨相關(guān)基因ALP(a)、C01-1(b)、Runx2(c)和OPN(d)的表達(dá)Fig. 6 Expression of osteogenic related genes：ALP(a)、C01-1(b)、Runx2(c)和OPN(d)

a：初始寬度；b：PCL組；c：PCL/5%CuO組；d：PCL/10%CuO組a: initial width; b: PCL group; c: PCL/5%CuO group;d: PCL/10%CuO group圖7 rBMSCs與浸提液共培養(yǎng)6 h后的遷移寬度(標(biāo)尺：200 μm)Fig. 7 Migration width of rBMSCs after co-culture with extracts for 6 hours (scale bar: 200 μm)

*： 與PCL組相比，P<0.05；ns:P>0.05*: compared with PCL group, P<0.05；ns:P>0.05圖8 rBMSCs與浸提液共培養(yǎng)6 h后的遷移寬度分析Fig. 8 Quantitative analysis of rBMSCs migration after co-culture with extracts for 6 hours

2.3 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1浸提液抑菌實(shí)驗(yàn)

如圖9所示，在4 h內(nèi)，各組間的細(xì)菌活性無(wú)明顯差異(P>0.05)，從5 h開始，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組浸提內(nèi)的OD值明顯低于PCL組和TSB組(P<0.05)。

圖9 浸提液抑菌實(shí)驗(yàn)Fig. 9 Antibacterial experiment of extracts

2.3.2抗細(xì)菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)1 h后，TSB組和PCL組已經(jīng)有細(xì)菌黏附，但PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組幾乎沒有細(xì)菌黏附。6 h后，PCL/5%CuO組和PCL/10%CuO組有較多細(xì)菌生長(zhǎng)，但未形成細(xì)菌生物膜，而TSB組和PCL組已形成致密的細(xì)菌生物膜(圖10)。

圖10 抗細(xì)菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)Fig. 10 Photographs of antibacterial biofilm formation

3 討論

創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性疾病等造成的骨缺損或損傷，是臨床面對(duì)的巨大挑戰(zhàn)之一。目前，骨缺損的修復(fù)方法主要有兩大類：骨移植和骨移植替代材料。骨移植包括自體骨移植、同種異體骨移植和異種異體骨移植等，這些方法存在供骨量有限、傳播傳染性疾病和引起免疫排斥反應(yīng)等潛在危險(xiǎn)。骨移植替代材料中生物陶瓷材料降解過快、早期無(wú)法承重，植入部位易塌陷；醫(yī)用金屬材料則缺乏必要的生物降解性和生物活性，且彈性模量遠(yuǎn)高于人骨，易產(chǎn)生應(yīng)力遮擋效應(yīng)，引發(fā)植入物周圍骨吸收、萎縮等風(fēng)險(xiǎn)。

近年來，骨組織工程和3D打印技術(shù)發(fā)展迅速，通過對(duì)材料進(jìn)行改性，可研發(fā)兼具可降解性和生物活性的骨修復(fù)支架。因此，我們通過FDM技術(shù)制備了具有良好生物學(xué)性能的PCL/CuO多孔支架。Cu2+釋放實(shí)驗(yàn)表明，PCL/CuO支架材料可以穩(wěn)定釋放Cu2+。研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+可促進(jìn)rBMSCs的增殖，還可增強(qiáng)其成骨分化[10-11]。本研究結(jié)果顯示，rBMSCs在PCL/5%CuO和PCL/10%CuO組有更多的黏附和增殖。在早期成骨階段，PCL/5%CuO和PCL/10%CuO組ALP染色明顯強(qiáng)于PCL組，ALP活性定量顯示，PCL/10%CuO組>PCL/5%CuO組>PCL組。在成骨晚期階段，茜素紅的染色結(jié)果與ALP染色一致，PCL/5%CuO和PCL/10%CuO組茜素紅染色更深，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量更多，且PCL/10%CuO組有更強(qiáng)的促成骨性能，提示浸提液中較高濃度的Cu2+可以持續(xù)促進(jìn)rBMSCs的成骨分化。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，PCL/5%CuO和PCL/10%CuO組成骨相關(guān)基因Col-1、ALP、Runx2、OPN的表達(dá)均明顯升高。Li等[12]認(rèn)為，Cu2+可以激活rBMSCs缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路，促進(jìn)rBMSCs的增殖和成骨分化。但是，Cu2+對(duì)rBMSCs的具體生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

銅是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的相關(guān)生物酶的輔助因子，對(duì)細(xì)胞的遷移有一定的影響[13-14]。促進(jìn)rBMSCs遷移是復(fù)合材料生物細(xì)胞學(xué)活性的重要特征，遷移到骨缺損部位的rBMSCs能夠促進(jìn)骨缺損修復(fù)。因此，細(xì)胞在材料表面及周圍的遷移情況在一定程度上體現(xiàn)了該材料的促進(jìn)骨缺損修復(fù)的能力。實(shí)驗(yàn)中，我們用支架浸提液與rBMSCs共培養(yǎng)6 h后發(fā)現(xiàn)，PCL/CuO組的劃痕距離明顯縮小，表明支架浸提液中的Cu2+可以促進(jìn)rBMSCs的遷移。

銅還具有良好的抗菌作用，可有效抑制包括耐MRSA在內(nèi)的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌[15]。相對(duì)于銀、鋁、鋅等離子，Cu2+在抗菌與生物相容性之間可以達(dá)到完美的平衡[16]。Cu2+作為一種廣譜抗菌劑，其抗菌機(jī)制包括破壞細(xì)菌DNA、裂解細(xì)菌胞膜和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性[17-19]。實(shí)驗(yàn)中，我們用支架浸提液與MRSA共培養(yǎng)，通過檢測(cè)OD值及細(xì)菌活死染色，發(fā)現(xiàn)PCL/5%CuO和PCL/10%CuO組支架可以有效抑制MRSA繁殖和細(xì)菌生物膜形成，顯示了良好的抗菌性能，在預(yù)防植入物感染方面有潛在作用。

綜上所述，F(xiàn)DM技術(shù)制備的PCL/CuO多孔骨修復(fù)支架在體外研究中有效地促進(jìn)了rBMSCs的增殖、成骨分化和遷移，顯著抑制了MRSA的繁殖和細(xì)菌生物膜形成，其中PCL/10%CuO組具有最佳的促成骨性能與抗菌性能，有望為骨缺損修復(fù)的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用提供新的思路。