CHEONG Sou San(張素珊) 李赟 于貞成 趙丹陽(yáng) 崔巖 曹怡 韓冬

由急性外傷或慢性退行性病變引起的肩袖損傷在臨床較為常見(jiàn)。大多數(shù)肩袖損傷發(fā)生在肌腱與骨的界面附近，主要表現(xiàn)為肌腱止點(diǎn)處骨骼的礦物質(zhì)流失和界面纖維軟骨的無(wú)法再生[1-3]。肩袖具有復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，使臨床治療肩袖損傷的效果非常有限，恢復(fù)肩袖的解剖結(jié)構(gòu)與功能是亟待解決的難題。

肌腱是通過(guò)纖維或纖維軟骨止點(diǎn)附著在骨上，而肩袖損傷時(shí)通常是纖維軟骨止點(diǎn)的撕裂[4]，而纖維軟骨的無(wú)法再生成為了肩袖難以愈合的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)，隨著對(duì)肌腱和骨愈合生物學(xué)機(jī)制的深入研究，用于加強(qiáng)腱-骨愈合的新的組織工程技術(shù)也有了一定發(fā)展。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有較強(qiáng)的多分化潛能，可能是修復(fù)腱-骨界面的理想種子細(xì)胞，Ouyang等[5]的研究證明了BMSCs能改善腱-骨止點(diǎn)的愈合。此外，應(yīng)用BMSCs治療肩袖損傷的實(shí)驗(yàn)表明，軟組織和骨之間整體的接觸區(qū)域是愈合的主要決定因素[6]，提高接觸區(qū)域的面積也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。甲基丙烯酸酐化明膠(Gelatin methacrylate，GelMA)是一種光敏性生物水凝膠材料，具有良好的生物相容性，能為干細(xì)胞提供類(lèi)似于天然細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)環(huán)境，并具有快速成膠性，可有效包裹大量細(xì)胞，故成為了一種優(yōu)良的細(xì)胞載體。另外，GelMA來(lái)源廣泛，液體形式可填充各種結(jié)構(gòu)的缺損，對(duì)于復(fù)雜的肩袖結(jié)構(gòu)，能達(dá)到提升整體愈合接觸面的目的[7-9]。因此，GelMA水凝膠是一種理想的組織工程材料[10]。為解決肩袖愈合的難題，本研究擬將GelMA包裹具有多種分化潛能的BMSCs后加載至腱-骨損傷界面，觀察BMSCs/GelMA水凝膠應(yīng)用于肩袖損傷后對(duì)腱-骨愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(Gibco，美國(guó))；大鼠BMSCs成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；甲基丙烯酸酐化明膠、LAP光引發(fā)劑(蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；活/死細(xì)胞雙染色試劑盒(KTA1001，武漢Abbkine生物技術(shù)公司)；Actin-Tracker Green微絲綠色熒光探針(C1033，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蘇木素-伊紅染色試劑盒、Masson三色染色液、改良番紅O-固綠軟骨染色液(北京索萊寶科技有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa，日本)。

酶標(biāo)儀(Synergy H1，BioTek，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(TS2，Nikon，日本)、正置光學(xué)顯微鏡(Eclipse E100，Nikon，日本)、激光共聚焦顯微鏡(ECLIPSE Ti，Nikon，日本)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI7500，ABI，美國(guó))；生物力學(xué)測(cè)定儀(Instron，美國(guó))。

1.2 BMSCs分離與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取近交系Wistar大鼠(上海甲干生物科技有限公司)，2周齡，雄性，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。無(wú)菌條件下完整取出后肢的股骨和脛骨，剪去骨干兩端，沖洗骨髓腔，收集沖洗液至培養(yǎng)皿，加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每3 d換液一次，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，達(dá)80%聚集后傳代。取第2、3代細(xì)胞備用。

1.3 克隆形成能力檢測(cè)

為檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的自我更新潛能，取第2代培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)其克隆形成能力。以10個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。第14天時(shí)終止培養(yǎng),鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞固定后用0.5%w/V結(jié)晶紫染色，待干燥后拍照觀察細(xì)胞集落數(shù)。

1.4 三系分化鑒定

取第2代細(xì)胞進(jìn)行三系分化鑒定。成骨分化：按2×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組(n=3)加入成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，對(duì)照組(n=3)使用完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，加入茜素紅染液并鏡下觀察。成脂分化：以2×104個(gè)/孔接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組(n=3)加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，對(duì)照組(n=3)加完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后加入油紅O染色，鏡下觀察。成軟骨分化：按2×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組(n=3)加入成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，對(duì)照組(n=3)加完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，加入阿利新藍(lán)染液染色，鏡下觀察。

1.5 構(gòu)建BMSCs/GelMA水凝膠

先將GelMA凍干粉溶解于PBS溶液中制得10%w/V的工作液，光引發(fā)劑Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate(LAP)粉末溶解于PBS溶液中制得0.5%w/V的工作液。取第3代BMSCs加入GelMA溶液，使最終細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，而GelMA和LAP的終濃度分別為5%w/V和0.1%w/V。吹打混勻后，吸取30 μL含BMSCs的GelMA溶液至圓孔模具中，迅速以405 nm藍(lán)光照射20 s進(jìn)行光交聯(lián)固化；成膠后，將BMSCs/GelMA水凝膠小心轉(zhuǎn)移至48孔培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基后置于CO2培養(yǎng)箱中。

1.6 BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞增殖檢測(cè)

BMSCs/GelMA水凝膠在體外培養(yǎng)1、3、5和7 d時(shí)，分別行CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖情況。按照培養(yǎng)基∶CCK-8=10∶1的比例，向每孔中加入一定量的CCK-8溶液，孵育4 h后，取10 μL上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本量為3個(gè)。

1.7 BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

微絲綠色熒光探針(Actin-Tracker Green)是結(jié)合發(fā)綠色熒光FITC的鬼筆環(huán)肽溶液。在BMSCs/GelMA水凝膠體外培養(yǎng)第7天時(shí)，以4%多聚甲醛固定1 h，再使用Actin-Tracker Green進(jìn)行細(xì)胞骨架內(nèi)微絲染色，并用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色情況，以檢測(cè)GelMA水凝膠中的細(xì)胞形態(tài)。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選取36只近交系Wistar大鼠(8周，雄性)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組(n=12)：①BMSCs/GelMA水凝膠組，修復(fù)術(shù)中加入BMSCs/GelMA水凝膠；②GelMA水凝膠組，修復(fù)術(shù)中加入GelMA水凝膠；③對(duì)照組，僅行修復(fù)手術(shù)。

手術(shù)方法(圖1)：大鼠麻醉后常規(guī)消毒，于肩部外側(cè)切開(kāi)皮膚，縱行切開(kāi)三角肌，仔細(xì)解剖顯露肱骨大結(jié)節(jié)后即找到岡上肌肌腱止點(diǎn)，銳利刀片切斷肌腱止點(diǎn)，并刮除纖維軟骨。5-0 PDS線穿過(guò)肌腱斷端，以23 G針頭橫行穿過(guò)肱骨頭形成隧道，縫線穿過(guò)針頭以通過(guò)隧道。縫線打結(jié)前，分別于腱-骨止點(diǎn)位置植入BMSCs/GelMA水凝膠或GelMA水凝膠。對(duì)照組無(wú)植入材料，直接打結(jié)固定肌腱斷端于肱骨頭處。最后逐層縫合以關(guān)閉切口。術(shù)后大鼠前肢活動(dòng)不受限，手術(shù)切口每日消毒護(hù)理。術(shù)后2、4周時(shí)各取材6只進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

圖1 肩袖撕裂動(dòng)物模型手術(shù)示意圖(黑色實(shí)線箭頭為岡上肌肌腱，白色箭頭為被針頭穿過(guò)的肱骨頭，黑色虛線箭頭為打結(jié)前放置的GelMA材料)Fig. 1 The animal model for rotator cuff tears and surgical repair procedure (The supraspinatus tendon indicated by the black solid arrow; The needle through the humeral head indicated by the white arrow; Implanted GelMA denoted by black dotted arrow)

1.9 腱-骨界面組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后4周時(shí)，每組取樣進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)(n=4)。完整取下肩袖關(guān)節(jié)后，除保留岡上肌肌腱，其余肌腱和韌帶完全去除，4%多聚甲醛固定后，浸入乙二胺四乙酸二鈉溶液中脫鈣1個(gè)月。脫鈣后進(jìn)行常規(guī)脫水和浸蠟包埋，切片(厚度4 μm)，HE染色，觀察細(xì)胞修復(fù)和界面愈合情況； Masson三色染色，觀察膠原纖維分布情況；番紅O-固綠染色，觀察修復(fù)部位的軟骨生成和骨組織形態(tài)。

1.10 腱-骨界面相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

以實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reactions，qPCR)檢測(cè)腱-骨界面相關(guān)基因的表達(dá)。選取的基因?yàn)榧‰煜嚓P(guān)基因Scleraxis(Scx)，成骨相關(guān)基因runt-relatedtranscriptionfactor2(Runx2)，軟骨相關(guān)基因collagentypeⅡ(Col2)和sex-determiningregionY-box9(Sox9)。根據(jù)GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物(表1)。在術(shù)后2周和4周，收集每組的肩袖樣本(n=6)，保留岡上肌肌腱，去除其余肌腱和韌帶，樣本以液氮研磨，加入TRIzol裂解液并提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Scx、Runx2、Col2和Sox9基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.11 腱-骨界面生物力學(xué)檢測(cè)

在術(shù)后4周進(jìn)行取材(n=6)，獲取肩袖樣本后，保留肱骨和肩胛骨及其上的肌肉，保留岡上肌肌腱，其余肌腱和韌帶完全切斷，獲取標(biāo)本(圖2)。在Instron力學(xué)測(cè)定儀上，將肱骨與肩胛骨分別以上、下夾具固定，設(shè)定預(yù)張力0.1 N，逐漸向上拉伸上夾具，直至肌腱完全斷裂，記錄拉伸過(guò)程中肌腱斷裂時(shí)的最大抗張力。

圖2 用于生物力學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本(黑色箭頭所指為岡上肌肌腱止點(diǎn))Fig. 2 Specimen for biomechanical tests (black arrow indicating supraspinatus tendon insertion)

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的克隆形成能力與三系分化鑒定

克隆形成能力：提取的細(xì)胞體外培養(yǎng)14 d后，結(jié)晶紫染色可見(jiàn)皿底部有多個(gè)單細(xì)胞克隆形成，肉眼可見(jiàn)直徑大于2 mm的細(xì)胞集落分布(圖3)。

圖3 第2代BMSCs克隆形成檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Colony-forming analysis of P2 BMSCs

三系分化結(jié)果顯示：提取細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)并行茜素紅染色，肉眼可見(jiàn)橙紅色的陽(yáng)性反應(yīng)，倒置顯微鏡下可見(jiàn)橙紅色鈣結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)并行油紅O染色，鏡下可見(jiàn)脂滴并顯示光亮的圓形脂肪細(xì)胞，有的呈現(xiàn)鮮紅色串珠狀；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)并行阿利新藍(lán)染色，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染(圖4)。

2.2 BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞增殖情況

在體外培養(yǎng)1、3、5和7 d，BMSCs/GelMA水凝膠上清液的OD值分別為0.69±0.01、1.22±0.04、1.34±0.04和1.82±0.10，表明GelMA水凝膠中的細(xì)胞在培養(yǎng)的7 d內(nèi)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中第7天比第1天的OD值增加了近3倍(圖5)。

圖4 第2代BMSCs的成骨、成脂和成軟骨分化Fig. 4 Osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of P2 BMSCs

圖5 CCK-8檢測(cè)BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞增殖情況Fig. 5 Cell proliferation in BMSCs/GelMA hydrogels detected by CCK-8 assay

2.3 BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)過(guò)7 d體外培養(yǎng)，對(duì)BMSCs/GelMA水凝膠進(jìn)行細(xì)胞骨架Actin染色。激光共聚焦顯微鏡下可觀察到包裹于水凝膠中的BMSCs細(xì)胞核藍(lán)染(DAPI染色)，細(xì)胞骨架發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞伸展較好，形態(tài)為多態(tài)性，多呈單層生長(zhǎng)(圖6)。

圖6 體外培養(yǎng)7 d后BMSCs/GelMA水凝膠的細(xì)胞骨架微絲染色(500×)Fig. 6 Actin staining of the BMSCs/GelMA hydrogels after cultured 7 days in vitro (500×)

2.4 腱-骨界面組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切口已痊愈。HE染色顯示，與其余兩組相比，BMSCs/GelMA水凝膠組纖維軟骨生成較多，在10倍鏡下觀察到軟骨生成明顯，顯示均勻、豐富的纖維軟骨細(xì)胞分布。術(shù)后4周肌腱仍處于修復(fù)狀態(tài)，肌腱組織排列無(wú)序緊密。Masson三色染色顯示BMSCs/GelMA組和GelMA組均呈現(xiàn)大面積藍(lán)染的膠原纖維組織，表明兩組有較豐富的膠原生成和沉積；反之，對(duì)照組中藍(lán)染相對(duì)弱，表明膠原纖維生成相對(duì)少。番紅O-固綠染色顯示BMSCs/GelMA組與GelMA組紅色纖維軟骨層清晰可見(jiàn)，表明腱-骨界面之間良好的纖維軟骨再生，而對(duì)照組紅色軟骨層較少(圖7)。

圖7 肩袖切片的組織學(xué)染色結(jié)果(黑色箭頭指向軟骨細(xì)胞層；白色箭頭指向膠原纖維組織層；綠色箭頭為處于修復(fù)的肌腱)Fig. 7 Histological staining of rotator cuff in cross-section (Black arrows: formation of chondrocytes; White arrows: collagen fibers; Green arrows: tendon being repaired)

2.5 腱-骨界面相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

qPCR檢測(cè)腱-骨界面相關(guān)基因在愈合過(guò)程中的表達(dá)情況，BMSCs/GelMA組與另外兩組相比，Col2的基因表達(dá)在術(shù)后4周比術(shù)后2周高出2倍(P<0.01)。由于術(shù)后4周是肩袖損傷后愈合的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)刻，Col2基因在術(shù)后4周的表達(dá)上調(diào)提示了腱-骨界面之間纖維軟骨再生能力的提高。此外，在術(shù)后2周，與其余兩組相比，BMSCs/GelMA組Scx、Runx2和Sox9基因表達(dá)水平均有明顯增加(P<0.05)，說(shuō)明在肩袖損傷的早期愈合過(guò)程中，BMSCs具有潛在的成肌腱、成骨和成軟骨分化能力，即具有良好的腱-骨界面修復(fù)能力(圖8)。

*： P<0.05；**： P<0.01圖8 qPCR檢測(cè)各組肩袖愈合相關(guān)基因表達(dá)Fig. 8 qPCR demonstrated mRNA expression levels of rotator cuff healing related genes in each group

2.6 腱-骨界面生物力學(xué)檢測(cè)

術(shù)后4周，測(cè)量3組肩袖腱-骨止點(diǎn)斷裂時(shí)的最大負(fù)荷并進(jìn)行比較，結(jié)果(圖9)顯示： BMSCs/GelMA水凝膠組的最大負(fù)荷為(12.435 ± 2.92) N，GelMA水凝膠組為(11.94 ± 2.93) N，對(duì)照組為(12.21 ± 2.66) N，3組間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖9 術(shù)后4周各組生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig. 9 Results of biomechanical tests in each group 4 weeks after operation

3 討論

由于肩袖多層結(jié)構(gòu)的組織復(fù)雜性，肩袖損傷后無(wú)法恢復(fù)正常分層結(jié)構(gòu)，故難以達(dá)到功能性愈合。隨著再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，組織工程技術(shù)對(duì)解決這一臨床難題展現(xiàn)出美好的前景。既往研究表明，肩袖損傷多發(fā)生在含纖維軟骨的界面上，其治療目標(biāo)是防止纖維性瘢痕組織增生和再生纖維軟骨層[11]。在細(xì)胞治療中，BMSCs經(jīng)常被用于加強(qiáng)肩袖愈合，但其治療效果不顯著，分析原因可能是細(xì)胞與腱-骨界面的接觸面積不足。

本實(shí)驗(yàn)利用GelMA包裹BMSCs，并將其植入肩袖損傷模型中，以提高BMSCs與腱-骨界面的接觸面積，加大細(xì)胞治療的細(xì)胞量。結(jié)果表明，通過(guò)GelMA水凝膠介導(dǎo)的BMSCs顯示出良好的細(xì)胞增殖性和細(xì)胞形態(tài)，能較好地發(fā)揮細(xì)胞治療效果。GelMA水凝膠主要成分為明膠[12]，與膠原比較，明膠具有更高的溶解性和更低的抗原性，為細(xì)胞生長(zhǎng)和組織形成提供了良好的微環(huán)境。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組指標(biāo)的檢測(cè)印證了BMSCs/GelMA水凝膠的植入促進(jìn)了腱-骨界面愈合能力。生物力學(xué)檢測(cè)中，各組未顯示出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能由于觀察的愈合時(shí)間還不夠長(zhǎng)。

近十余年來(lái)，關(guān)于細(xì)胞與生物材料界面的研究多已轉(zhuǎn)移到微環(huán)境三維立體培養(yǎng)模式。GelMA水凝膠固有的生物活性和快速光交聯(lián)的物理化學(xué)特性[13]，雖然能快速、有效地將多量細(xì)胞轉(zhuǎn)移至體內(nèi)，但目前GelMA水凝膠的應(yīng)用受限于其較低的機(jī)械強(qiáng)度，可考慮對(duì)其加以修飾，以調(diào)節(jié)各種特性，例如物理強(qiáng)度、化學(xué)性質(zhì)、電導(dǎo)率和孔隙率等[14]。已證實(shí)碳納米管與GelMA復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能可通過(guò)控制摻入的碳納米管的比例進(jìn)行調(diào)整[15]。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)，一種在隱形眼鏡中廣泛使用的生物材料聚甲基丙烯酸2-羥乙酯(pHEMA)能以互相穿插技術(shù)摻入負(fù)載有角膜細(xì)胞的GelMA水凝膠以增強(qiáng)其機(jī)械性能，體外測(cè)試結(jié)果顯示，載有細(xì)胞的GelMA/HEMA角膜基質(zhì)模型具有合適的機(jī)械強(qiáng)度[16]。

綜上所述，基于GelMA水凝膠的干細(xì)胞治療方法可有效加強(qiáng)肩袖損傷的愈合，但在將來(lái)的工作中，要進(jìn)一步研究如何提高GelMA的機(jī)械性能以提升對(duì)肌腱-骨的修復(fù)，為臨床上組織損傷的治療提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。