王永靈 蕢綱 廖明娟 李琰

難愈性創(chuàng)面是指多種原因?qū)е碌碾y以在預期時間內(nèi)自行修復的創(chuàng)面，臨床中較為常見，近年來發(fā)生率呈上升趨勢[1]。難愈性創(chuàng)面的病程及療程均較長，創(chuàng)面上覆蓋壞死組織，長期不液化，阻礙肉芽組織生長，部分肉芽組織暗紅、老化，臨床治療效果不明顯。紫歸長皮軟膏是我院自制的傳統(tǒng)制劑，臨床治療難愈性創(chuàng)面效果非常明顯[2]，具有促進創(chuàng)面內(nèi)壞死組織液化、肉芽轉(zhuǎn)紅，促進愈合的作用。本實驗旨在探討紫歸長皮軟膏對大鼠難愈性創(chuàng)面組織神經(jīng)修復環(huán)節(jié)的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量162～200 g，平均(181.04±7.21)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(滬)：2008-0016。隨機分為4組：正?？瞻捉M、模型空白組、紫歸長皮軟膏組和貝復濟組，每組8只。

1.2 實驗藥物

貝復濟(63 000 IU/瓶)，為珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)(批準文號：國藥準字S10980077)；紫歸長皮軟膏(滬藥制字Z05060611)，我院制劑室提供。0.9%生理鹽水，上海長征富民金山制藥有限公司生產(chǎn)(批準文號：國藥準字H31021918)；戊巴比妥鈉，上海中醫(yī)藥大學動物房配置提供；氫化可的松琥珀酸鈉(每支50 mg)，天津生物化學制藥有限公司生產(chǎn)(批號：20101010)。

1.3 試劑與儀器

免疫組織化學-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法試劑盒(美國Zymed公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(北京中山生物技術有限公司)；CGRP一抗(兔抗鼠，1∶50稀釋，美國Santa Cruz公司)；EnVision試劑(HRP/Rabbit，抗兔即用型，丹麥Dako公司)；生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G(德國Vector公司)。

上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗室提供的儀器與設備：IMS細胞圖像分析儀系統(tǒng)和醫(yī)學圖像分析軟件(上海申騰信息技術有限公司)；攝像機(MV-CP410，日本Panasonic公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；切片機(RM2145，德國Leica公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-S22，上海精宏實驗設備有限公司)。

1.4 方法

1.4.1造模方法[3]

除正?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)外，其余3組大鼠均肌內(nèi)注射氫化可的松琥珀酸鈉(80 mg/kg)，連續(xù)3 d。第4天進行創(chuàng)面造模。4組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉(0.02 mg/kg)，麻醉成功后于造模區(qū)(腰椎正中偏上)剃毛，標記15 mm圓形造模區(qū)域，消毒，沿標記線剪去皮下組織至肌筋膜，制成大鼠全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面模型。正常空白組、模型空白組采用生理鹽水紗布覆蓋傷口；貝復濟組外用貝復濟噴涂傷口；紫歸長皮軟膏組采用紫歸長皮軟膏外敷。各組創(chuàng)面處理后，均用無菌紗布包扎。模型空白組、貝復濟組和紫歸長皮軟膏組于創(chuàng)面造模當天、次日分別肌注氫化可的松琥珀酸鈉，完成難愈性創(chuàng)面模型。大鼠4只一籠飼養(yǎng)，自由進水飲食。造模后各組每天換藥1次。換藥時均用0.1%利凡諾溶液消毒傷口。分別于第7天及第10天取創(chuàng)面組織標本。

1.4.2CGRP免疫組化

組織標本石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水；PBS洗3 min，3次；用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH6.0)熱誘導修復，室溫自然冷卻；PBS洗3 min，3次；0.3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶20 min；PBS洗3 min，3次；20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗；滴加CGRP一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗3 min，3次；EnVision試劑37 ℃孵育30 min；PBS洗3 min，3次；DAB顯色8～12 min；蘇木精襯染，熱水藍化；吹干后，樹脂封片；鏡下觀察，背景呈紫藍色，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。

通過顯微鏡、圖像采集卡、攝像機或數(shù)碼相機采集數(shù)字圖像。測定圖像中陽性區(qū)域面積和光密度值，兩者的乘積代表CGRP表達水平。每張切片分析3個視野，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

CGRP陽性染色呈棕黃色或褐色，主要分布在胞質(zhì)或間質(zhì)中。由于染色分布面積有大小，染色的強弱并不均勻，故以陽性區(qū)域面積百分比(染色分布)和光密度值(染色的強弱)的乘積來進行比較。

正?？瞻捉M、模型空白組、紫歸長皮軟膏組及貝復濟組均有CGRP表達，散在分布，陽性染色多分布于纖維上，也可見成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞被染(圖1)。

A：正?？瞻捉M造模第7天；B：正?？瞻捉M造模第10天；C：模型空白組造模第7天；D：模型空白組造模第10天；E：紫歸長皮軟膏組造模第7天；F：紫歸長皮軟膏組造模第10天；G：貝復濟組造模第7天；H：貝復濟組造模第10天A: At modeling day 7 of normal blank group; B: At modeling day 10 of normal blank group; C: At modeling day 7 of model blank group; D: At modeling day 10 of model blank group; E: At modeling day 7 of Zigui Changpi Paste group; F: At modeling day 10 of Zigui Changpi Paste group; G: At modeling day 7 of bfgf-torita group; H: At modeling day 10 of bfgf-torita group圖1 各組組織學觀察Fig. 1 Histological observation of each group

如圖2所示，在創(chuàng)傷第7天，各組分別進行兩兩比較，各組間CGRP表達均有顯著性差異(P<0.05)，CGRP相對表達量由高到低分別為紫歸長皮軟膏組、正常空白組、模型空白組、貝復濟組。在創(chuàng)傷第10天，各組間CGRP表達亦存在顯著性差異(P<0.05)，CGRP相對表達量由高到低分別為紫歸長皮軟膏組、正常空白組、模型空白組、貝復濟組。另外，創(chuàng)傷后第10天與第7天相比，各組CGRP表達均有顯著下降(P<0.05)。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面的CGRP表達Fig. 2 CGRP expression of the wound in each group

3 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子在難愈性創(chuàng)面的愈合過程中十分重要[4]。降鈣基因素相關肽(CGRP)是一種神經(jīng)肽，它的表達不僅與神經(jīng)損傷及修復再生有一定的相關性，在創(chuàng)面愈合中還具有多種作用[5-6]，可促進培養(yǎng)的成纖維細胞遷移，加速細胞分裂、增殖，并可促進傷后血管形成[7-9]。神經(jīng)肽還能作用于免疫系統(tǒng)的巨噬細胞、肥大細胞、白細胞介素等構成神經(jīng)免疫反應，通過調(diào)節(jié)這些細胞的功能而影響其釋放細胞因子及生長因子，從而參與創(chuàng)傷修復中細胞增殖、分化的調(diào)節(jié)[10-11]。

紫歸長皮軟膏由當歸、生地、紫草、地骨皮、大黃、象皮粉等組成，具有祛腐托腐、補血活血、生肌長肉的作用[12-13]，臨床治療難愈性創(chuàng)面的效果非常明顯。本實驗以貝復濟為對照，并設正常空白組、模型空白組，觀察紫歸長皮軟膏對大鼠難愈性創(chuàng)面神經(jīng)修復的影響機制。結(jié)果顯示，CGRP在各組創(chuàng)傷后第7天及第10天時均有表達，表明CGRP參與創(chuàng)面的修復過程。貝復濟組的CGRP表達明顯低于其他各組，說明其對CGRP的表達可能產(chǎn)生了抑制作用，具體機制還有待進一步探討。紫歸長皮軟膏在創(chuàng)傷后第7天及創(chuàng)傷后第10天CGRP的表達均明顯高于其他各組，表明紫歸長皮軟膏具有促進創(chuàng)面CGRP的表達，進而促進創(chuàng)面愈合的作用。我們還發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后第10天與第7天相比，各組CGRP表達均有顯著下降(P<0.05)，這可能是因為創(chuàng)傷后第10天，創(chuàng)面已接近愈合，傷口表面需要的神經(jīng)營養(yǎng)因子逐漸減少的緣故；另外，CGRP除了來源于感覺神經(jīng)末梢外，炎癥細胞(巨噬細胞)也是一個重要來源[14]，因此該結(jié)果也可能與炎癥減輕有關。