梁文強(qiáng)，張懷斌，楊國(guó)清，楊杜斌，謝犇，王勇平, *

（1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院骨科；2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院骨科，蘭州 730000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種多能干細(xì)胞，能夠分化發(fā)育為不同組織，且來源廣泛，因此被視為骨組織工程良好的種子細(xì)胞[1]。骨折修復(fù)、骨缺損與骨不連、骨質(zhì)疏松等骨科常見疾病可以通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力尋求更加可靠的治療方案[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程受到多種因素的作用，近年的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程具有一定的作用。微小RNA（microRNA,miRNA）是一中高度保守的非編碼RNA，參與多種生理過程，如正常細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡，以及維持細(xì)胞的多能性[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longchain noncoding RNA, lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過200 nt 的RNA 分子，本身并不編碼蛋白，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程[4]。miRNA與lncRNA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響逐漸受到研究人員的重視，因此對(duì)兩者在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為骨組織工程和臨床治療提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 BMSCs向成骨分化

BMSCs是來源于中胚層的多能干細(xì)胞，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，甚至成肌細(xì)胞，因此被認(rèn)為是多潛能細(xì)胞。更重要的是，BMSCs可以從成人組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，包括骨髓、臍帶血、脂肪組織和牙齒組織[5-7]，由于BMSCs取材來源廣泛并且具有多向分化、自我更新、免疫調(diào)節(jié)等功能，已成為基因治療、組織工程、細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)中種子細(xì)胞的重要來源。

成骨細(xì)胞可以促進(jìn)鈣鹽在骨基質(zhì)中的沉積，從而促進(jìn)骨的重建。此外，矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2, RUNX2)、堿 性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨橋蛋白（osteopontin, OPN）可用于檢測(cè)BMSCs的成骨分化程度[8]。近年來，骨再生和骨形成已成為骨組織學(xué)研究的重要方向。其中，成骨細(xì)胞在骨再生和骨形成中起著重要作用，因此，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化在骨組織工程中非常重要。BMSCs成骨分化受多種信號(hào)通路的影響，其中最為經(jīng)典的信號(hào)通路是Wnt 信號(hào)通路，BMP-Smads信號(hào)通路也是參與調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化及骨形成的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)成骨與抑制成骨的雙向作用，HIPPO-YAP/TAZ通路通過與其他信號(hào)通路之間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控BMSCs的增殖及成骨分化，MAPK信號(hào)通路通過上調(diào)Runx2的表達(dá)[5]，促進(jìn)BMSCs成骨向分化過程[4]。

2 miRNA對(duì)BMSCs成骨分化的影響

許多研究表明，miRNAs在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起重要作用。Dicer是miRNA合成所必需的內(nèi)切酶，Oskowitz等人敲除小鼠核酸內(nèi)切酶Dicer后，發(fā)現(xiàn)小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞失去了成骨分化的能力，從而證明miRNA與骨的形成和發(fā)育密切相關(guān)[9]。miRNA在成骨分化過程中扮演不同的角色，既可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，也有許多miRNA抑制BMSCs的成骨分化。

2.1 miRNA對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用不少miRNA具有促進(jìn)成骨分化的作用，例如，miR-92b-5p、miR-187-5p、miRNA-27a、miRNA-130a、miRNA-27b、miRNA-128-3p、miRNA-199a、miR-378a-3p、miR-21和miR-26a等都能促進(jìn)BMSCs的成骨分化（表1）。

Yuan等[10]通過研究褪黑激素對(duì)BMSCs成骨分化的作用發(fā)現(xiàn)，褪黑素可上調(diào)miR-92b-5p的表達(dá)，并且miRNA-92b-5p通過直接靶向細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1（ICAM-1）參與BMSCs向成骨細(xì)胞分化。miRNA-187-5p同樣直接靶向作用于ICAM-1從而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[11]。Gu等[12]的研究結(jié)果顯示，miRNA-27a上調(diào)能夠促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化并且抑制成脂分化，并且發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ, PPARγ）和 骨形態(tài)形成蛋白拮抗蛋白1（gremlin1, GREM1）是miRNA-27a的直接作用靶點(diǎn)，為激素相關(guān)性骨壞死的治療提供了新的思路。Lin 等人[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-130a和miRNA-27b靶向結(jié)合PPARγ，促進(jìn)RUNX2和Osterix的基因表達(dá)，最終促使BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

Lin[14]等人通過對(duì)Wnt3α信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨分化的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-128-3p可顯著降低糖皮質(zhì)激素對(duì)骨R-羥基谷氨酸蛋白（bone gamma-carboxyglutamate protein, BGLAP）、RUNX2 、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2, BMP-2）的抑制作用，表明miRNA-128-3p具有促進(jìn)BMSCs成骨分化的能力，同時(shí)miRNA-128-3p正向調(diào)控Wnt3α信號(hào)通路并提升成骨分化過程中ALP的活性。對(duì)于長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的病人而言，藥物性骨質(zhì)疏松的情況不容忽視。miRNA-199a過表達(dá)后能夠逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用，miRNA-199a通過直接抑制Klotho蛋白和信使RNA表達(dá)促進(jìn)BMSCs的成骨分化，影響FGFR1/ERK 和JAK1/STAT1信號(hào)通路[15]。Yu等人[16]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-378a-3p可促進(jìn)老齡大鼠BMSCs成骨基因Runx2、ALP、Col I和骨鈣素（osteocalcin, OCN）的表達(dá)水平和ALP活性，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。Yan 等人[17]的實(shí)驗(yàn)表明，miRNA-21通過增加p-Akt和激活缺氧誘導(dǎo)因子‐1α，促進(jìn)BMSCs在體外的遷移和成骨分化，并促進(jìn)其成骨能力。由于RNA分子不穩(wěn)定容易降解，因此借助介孔硅納米顆粒的物理性質(zhì)，將其作為載體將miRNA-26a轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果表明載體在體外能保護(hù)miRNA-26a不被降解，并可顯著促進(jìn)rBMSCs的成骨分化[18]。

2.2 miRNA對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用

miRNA在BMSCs不僅可促進(jìn)成骨分化，一些miRNA對(duì)成骨分化過程有抑制作用。通過對(duì)此類miRNA及其作用靶點(diǎn)的研究可以為骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等疾病提供新的治療思路（表1）。

表1 miRNAs對(duì)BMSCs成骨分化的作用Tab. 1 The effect of miRNAs on osteogenic differentiation of BMSCs

Chen等[19]發(fā)現(xiàn)miRNA-17-3p在成骨過程中抑制礦化、ALP活性和成骨相關(guān)基因ALP、Col1A1和OPN的表達(dá)，在成骨細(xì)胞分化過程中直接調(diào)節(jié)Sox6的表達(dá)進(jìn)而抑制成骨分化。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥是由于BMSCs在高糖環(huán)境下生理功能異常所致，因此對(duì)于糖尿病性骨質(zhì)疏松相關(guān)miRNAs的研究成為當(dāng)下的熱點(diǎn)之一。miRNA-365a-3p通過靶向RUNX2負(fù)向調(diào)節(jié)hBMSCs的成骨分化，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展[20]。Wang等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境抑制了BMSCs的成骨分化，而且miRNA-214-3p的表達(dá)明顯上調(diào)，通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-214-3p通過靶向結(jié)合β‐catenin而發(fā)揮抑制BMSCs的成骨分化。Liu等[22]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-337可直接靶向作用于Ras相關(guān)蛋白1A（Ras-related protein Rab-1A,Rap1A）從而抑制經(jīng)過高糖處理的BMSCs向成骨細(xì)胞分化，這為臨床上糖尿病性骨質(zhì)疏松癥患者提供了潛在的治療方法。p53在骨形成過程中起負(fù)調(diào)控作用，p53誘導(dǎo)的miRNA-145a通過靶向作用核心結(jié)合因子β（Cbfb）抑制成骨分化，p53/miRNA-145a/Cbfb信號(hào)通路可能成為治療骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)[23]。

Yang等[24]在對(duì)骨質(zhì)疏松的研究中發(fā)現(xiàn)，叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box O1, FOXO1）在骨質(zhì)疏松組織中的表達(dá)水平低于鄰近非骨質(zhì)疏松組織，并且在骨質(zhì)疏松組織中，miRNA-1271-5p與FOXO1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；miRNA-1271-5p過表達(dá)下調(diào)BMSCs中的FOXO1表達(dá)，抑制其成骨分化。miRNA-493-5p通過直接靶向結(jié)合E盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E‐box binding homeobox 2, ZEB2）使其水平降低，進(jìn)一步使Wnt/b-catenin信號(hào)通路失活從而產(chǎn)生對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用[25]。

miRNA通過特定的靶點(diǎn)、信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化，對(duì)多條BMSCs成骨分化通路均有作用。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-19b-3p在BMSCs中過表達(dá)，并且靶向下調(diào)PTEN表達(dá)，促進(jìn)Akt和mTOR的磷酸化，從而通過自噬抑制BMSCs的成骨分化[26]。Wang等[27]證明miRNA-765能夠與Bmp6靶向結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控BMP6/Smad1/5/9信號(hào)通路來抑制hMSC的成骨分化。在對(duì)創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miRNA-93-5p通過靶向BMP-2抑制成骨分化，并且降低ALP、Runx-2等成骨相關(guān)基因的表達(dá)[28]。

3 lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的影響

lncRNA通過多條途徑發(fā)揮其生物學(xué)功能。傳統(tǒng)的機(jī)制包括與RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins,RBP）和染色質(zhì)修飾復(fù)合物結(jié)合、與miRNA競(jìng)爭(zhēng)、調(diào)節(jié)啟動(dòng)子和與轉(zhuǎn)錄相互作用。

3.1 lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用

一些lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的作用通過miRNA實(shí)現(xiàn)。Li[29]等發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19通過miR-532-3p/SIRT1信號(hào)通路介導(dǎo)雌激素促進(jìn)BMSCs成骨分化。lncRNA Gas5過表達(dá)通過miRNA-498上調(diào)RUNX2的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs的成骨分化，并且lncRNA Gas5在骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)較低[30]。Zhang等[31]同樣發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者血清中l(wèi)ncRNA XIXT表達(dá)明顯下調(diào)，lncRNA XIXT通過miRNA-30a-5p上調(diào)RUNX2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。有研究揭示了lncRNA Xist/miR-19a-3p/Hoxa5通路在誘導(dǎo)BMSCs成骨分化中的關(guān)鍵作用[32]。這些研究為骨質(zhì)疏松的靶向治療提供新思路。

Chen等發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)lncRNA MCF2L-AS1，lncRNA MCF2L-AS1通過吞噬miR-33a正向調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs的成骨分化；lncRNA HotTip通過與WDR5相互作用，上調(diào)β‐catenin基因表達(dá)，從而激活Wnt/β‐catenin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化[33]。另有研究表明，lncRNA TNCOS-00023297不僅有促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用，還可以促進(jìn)BMSCs分泌血管內(nèi)皮因子同時(shí)具有抑制成指分化的作用[34]。

表2 lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的作用Tab. 2 The effect of lncRNA on the osteogenic differentiation of BMSCs

3.2 lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用

近年的研究發(fā)現(xiàn)，一些lncRNA與骨質(zhì)疏松的發(fā)生較為密切，對(duì)此類lncRNA的研究或許能為臨床中骨質(zhì)疏松的診斷與治療提供新的方法與思路。Jiang等[35]通過小鼠建立骨質(zhì)疏松的模型后探究lncRNA對(duì)成骨分化作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1過表達(dá)增強(qiáng)發(fā)育下調(diào)蛋白4（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4, Nedd4）與p-p38的相互作用，破壞p-p38的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，促進(jìn)p-p38的泛素化，從而對(duì)P38信號(hào)通路產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，最終抑制BMSCs的成骨分化。有研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者血清和BMSCs中 lncRNA HOTAIR水平明顯高于正常人，進(jìn)一步抑制HOTAIR誘導(dǎo)BMSCs后發(fā)現(xiàn)，ALP活性升高，成骨標(biāo)志物基因增多，鈣化結(jié)節(jié)增多，而HOTAIR過表達(dá)則表現(xiàn)出相反的作用，在對(duì)具體機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用是通過對(duì)Wnt/β‐catenin通路的負(fù)向調(diào)控產(chǎn)生的[36]。同樣的Wang[37]的研究結(jié)果表明，在骨質(zhì)疏松成骨分化過程中，lncRNA DANCR和miRNA-320a通過抑制Wnt/β‐catenin信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，對(duì)成骨分化有一定的抑制作用。

He等[38]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ODIR1具有抑制BMSCs成骨分化的作用，ODIR1與F-box家族蛋白 成 員FBXO25 （F-box protein-25, FBXO25）相互作用，并通過募集CUL3促進(jìn)FBXO25的蛋白酶體依賴性降解，F(xiàn)BXO25增加H2BK120的泛素化，其隨后促進(jìn)H3K4的三甲基化，H2BK120ub和H3K4me3均形成松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OSX的轉(zhuǎn)錄，由此推論出lncRNA ODIR1通過FBXO25/H2BK120ub/H3K4me3/OSX信號(hào)通路抑制BMSCs成骨分化。

4 小結(jié)

BMSCs是組織工程成骨種子細(xì)胞的重要來源，在骨缺損修復(fù)和再生領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。miRNAs和lnc RNA在BMSCs成骨分化中起關(guān)鍵作用。隨著研究的進(jìn)展，針對(duì)miRNAs和lnc RNA靶基因的基因治療將使患者受益。此外，隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，BMSCs向成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制將日益清晰，從而為骨組織工程和臨床治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。