高海娟 ， 劉澤東 ， 孫 蕊

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省牧草育種與種質(zhì)資源利用工程技術(shù)研究中心，黑龍江齊齊哈爾161005）

苜蓿是我國種植面積最大的牧草品種，素有牧草之王的美稱，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素（王永新等，2012；許慶方等，2006），是家畜最為理想的飼草飼料，尤其是青貯后的苜蓿保持了青鮮飼料的鮮態(tài)和大部分營養(yǎng)，柔軟多汁，酸香可口，能提高家畜食欲，促進(jìn)家畜消化液的分泌和腸道蠕動 （高海娟等，2016）。苜蓿具有含水量高、緩沖能值高、粗蛋白質(zhì)含量高、可溶性碳水化合物含量低的特性，屬難青貯的作物（王永新等，2012；李向林等，2005；劉賢等，2004）。青貯時原料的含水量、施加添加劑種類、用量及貯藏天數(shù)對苜蓿青貯飼料的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)有很大的影響，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同添加劑、含水量、貯藏天數(shù)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，旨在篩選出三個因素最佳組合，為苜蓿青貯提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 青貯原料：初花期的紫花苜蓿，來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院科研基地。試驗(yàn)藥品及用品：纖維素酶、乳酸菌、烘箱、聚乙烯袋、噴壺、吸塵器等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用袋裝青貯方式，設(shè)計(jì)三因素三水平[A:添加劑種類:纖維素酶（300 g/t）+乳酸菌（106cfu/g）、乳酸菌（106cfu/g）、纖維素酶（300 g/t）；B:苜蓿含水量:65.79%、54.15%、47.03%；C：貯藏天數(shù):45、60、75 d]L9（33）正交試驗(yàn)，共 9 個處理組合（表1），每個處理組3次重復(fù)。

表1 三因素三水平正交試驗(yàn)表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯飼料的制作 初花期用鐮刀刈割苜蓿，留茬高度6 cm，將刈割后的苜蓿進(jìn)行晾曬，不同晾曬時間的苜蓿取樣帶回實(shí)驗(yàn)室，測定含水量。將苜蓿切割成3～4 cm長的小段。青貯原料與添加劑混合均勻后，裝入聚乙烯青貯袋（0.7 m×1.2 m）中，每袋20 kg左右，邊裝邊踩實(shí)壓緊，用吸塵器抽空氣處理，室溫條件下避光保存，按照試驗(yàn)組合達(dá)到青貯天數(shù)后開袋測定青貯料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)。

1.3.2 青貯飼料營養(yǎng)成分的測定 烘干法60℃下烘干24 h測定苜蓿原料含水量；烘干法105℃烘干8 h測定干物質(zhì)含量；采用改良式凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量；采用Van Soest的方法測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。

1.3.3 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)測定 采用離子色譜法檢測乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量；采用苯酚—次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮含量。

1.4 青貯飼料品質(zhì)評定標(biāo)準(zhǔn) 采用日本粗飼料評定中的V-Score評分體系進(jìn)行評定，該體系是以氨態(tài)氮、乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸為評定指標(biāo)進(jìn)行青貯品質(zhì)評價，各指標(biāo)含量不同分配的分?jǐn)?shù)不同。滿分為100分，根據(jù)這個評分，將青貯飼料品質(zhì)分為良好（80分以上）、尚可（60～80 分）、不良（60 分以下）3 個級別（表 2）。

表2 V-Score評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 因素影響分析 依據(jù)青貯品質(zhì)評定的分?jǐn)?shù)計(jì)算各個因素極差，分析各因素對苜蓿青貯品質(zhì)的影響程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel和SAS 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分 從表3中可以看出，試驗(yàn)組中含水量65.79%的三個處理組合苜蓿青貯料干物質(zhì)含量為32.39%～33.10%；含水量54.15%的三個處理組合干物質(zhì)含量為43.52%～43.66%；含水量47.03%的三個處理組合干物質(zhì)含量為50.31%～50.65%。苜蓿原料含水量越低，青貯飼料中干物質(zhì)含量越高。

正交試驗(yàn)9個處理粗蛋白質(zhì)含量為13.85%～18.62%，其中粗蛋白質(zhì)含量比較高的組合是A3B1C2和A3B2C1，分別為18.62%和18.41%；粗蛋白質(zhì)含量比較低的組合是A1B1C1和A3B3C3，分別為13.85%和14.29%，方差分析的結(jié)果，組合A3B1C2除了與A3B2C1和 A2B2C2差異不顯著外（P＞ 0.05），與其他處理差異都顯著（P＜ 0.05）（表 3）。

正交試驗(yàn)9個處理中性洗滌纖維含量為29.59% ～44.45%，其中以A1B1C1和 A3B3C3含量較低，為 29.59%和 32.28%；A2B1C3和 A1B3C2較高，為44.45%和43.31%，方差分析的結(jié)果，組合A1B1C1、A3B3C3中性洗滌纖維含量與其他處理差異性顯著（P＜ 0.05）（表 3）。

正交試驗(yàn)9個處理酸性洗滌纖維含量為26.43% ～38.13%，A3B1C2和 A1B1C1含量較低，為26.43%和28.69%，A3B3C3和A1B2C3含量較高，為38.13%和35.21%，方差分析的結(jié)果，組合A3B1C2、A3B3C3酸性洗滌纖維含量與所有的處理差異性均顯著（P＜ 0.05）（表 3）。

表3 正交試驗(yàn)苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分%

2.2 正交試驗(yàn)苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì) 從表4可知，正交試驗(yàn)9個處理組合pH為4.41～5.09，組合 A2B1C3和A1B1C1的 pH較低，為4.41和 4.48，組合A BC 和A BC 的pH較高，為5.09和4.98，綜合來看，含水量65.79%的處理組合pH較低，含水量47.03%的處理組合pH較高，方差分析表明，所有處理組合間的pH差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 正交試驗(yàn)苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)

氨態(tài)氮/總氮含量各個處理組合間變化幅度較大，為4.15% ～11.27%，其中A3B1C2氨態(tài)氮/總氮最低，僅為4.15%，A3B2C1和A1B1C1的氨態(tài)氮/總氮較高，為11.27%和11.01%，說明蛋白質(zhì)變性及水解的程度比較大，方差分析表明，組合A3B1C2氨態(tài)氮/總氮含量與其他各個處理組合差異均顯著（P＜ 0.05）（表 4）。

9個處理乳酸含量為3.26%～4.01%，A3B1C2乳酸含量最高，為4.01%，A1B3C2和A1B1C1的乳酸含量低，為3.26%和3.30%，組合A3B1C2乳酸含量僅與 A2B3C1、A1B3C2、A1B1C1差異顯著 （P＜ 0.05），與其他處理組合差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

乙酸含量為0.71%～1.19%，處理組合A1B3C2的乙酸含量最高，為1.19%，組合A1B1C1和A3B1C2乙酸含量較低，為0.71%和0.72%（表4）。

A1B2C3組合的丙酸含量最高，為0.93%，A3B1C2和A1B3C2處理組的丙酸含量較低，為0.55%和0.59%，其他的處理組合丙酸含量為0.59%～0.93%，各處理間丙酸含量差異不大（表4）。

A1B2C3、A1B3C2、A2B3C1、A3B3C3處理組合檢 測到的丁酸含量為0.06%～0.09%，其他處理組合沒有檢測到丁酸（表4）。

2.3 青貯飼料品質(zhì)綜合評價 由表5可知，9個處理組飼料最終評定結(jié)果是良好和尚可，以A3B1C2處理組合得分最高，為91.8分，即添加纖維素酶300 g/t，苜蓿含水量65.79%，貯藏60 d青貯品質(zhì)最好，綜合評價都為良好；A2B2C2（添加乳酸菌106cfu/g，苜蓿含水量54.15%，貯藏 60 d）次之，為86.3分，綜合評價都為良好；得分最低的是A2B3C1（添加乳酸菌 106cfu/g， 苜蓿含水量47.03%，貯藏45 d），為74.4分，綜合評價為尚可。

表5 正交試驗(yàn)苜蓿青貯飼料品質(zhì)得分及極差分析

2.4 正交設(shè)計(jì)分析 添加劑、含水量、貯藏時間3個因素對苜蓿青貯品質(zhì)的影響可用極差來衡量，極差越大，表明這個因素對苜蓿青貯品質(zhì)的影響越大。由表5正交設(shè)計(jì)分析所得極差大小可知，C因素的極差最大，為10.70，B因素次之，為5.77，A因素最小，為3.23，即C＞B＞A，說明3個因素中以貯藏天數(shù)對苜蓿青貯品質(zhì)的影響最大，原料的含水量次之，添加劑對苜蓿青貯品質(zhì)的影響最小。

正交試驗(yàn)中依據(jù)苜蓿青貯品質(zhì)綜合評分計(jì)算每個因素各個水平的平均值，所得平均值越大，說明該水平對苜蓿青貯品質(zhì)的作用越大，所得平均值越小，說明該水平對苜蓿青貯的作用越小。以各因素的各個水平為橫坐標(biāo)，綜合評分為縱坐標(biāo)，可以直觀的表示不同因素的各個水平對苜蓿青貯品質(zhì)的影響（圖1）。從圖1中可知，添加劑3個水平對苜蓿青貯品質(zhì)的作用A3＞A2＞A1，即添加纖維素酶＞乳酸菌＞纖維素酶+乳酸菌；原料含水量3個水平對苜蓿青貯品質(zhì)的作用是B1＞B2＞B3，即含水量65.79%＞54.15%＞47.03%；貯藏時間3個水平對苜蓿青貯品質(zhì)的作用是C2＞C3＞C1，即貯藏60 d＞75 d＞45 d。

3 討論

由于苜蓿具有緩沖能高、水分高、糖分含量低、可溶性碳水化合物含量低、有害菌比例大的特點(diǎn)，直接用其調(diào)制青貯飼料很難獲得良好的品質(zhì)。近年來研究表明，苜蓿原料中增加有益乳酸菌、纖維素酶等青貯添加劑有利于調(diào)制出優(yōu)質(zhì)的青貯飼料（馬春暉等，2010；Melvin，1965）。 添加乳酸菌制劑人工擴(kuò)大菌群，保證青貯初期發(fā)酵所需的乳酸菌數(shù)量，并使其盡快、盡早地進(jìn)入乳酸發(fā)酵優(yōu)勢；添加纖維素酶能降解青貯原料的結(jié)構(gòu)性碳水化合物為單糖或雙糖，可以為乳酸發(fā)酵提供更多可利用的底物（徐煒等，2014；李光耀等，2013）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加劑種類對苜蓿青貯品質(zhì)的作用是A3＞A2＞A1，即添加纖維素酶＞乳酸菌＞纖維素酶+乳酸菌；這與張新平等（2006）研究結(jié)果一致，單獨(dú)添加纖維素酶青貯效果好于乳酸菌和二者的混合劑。

含水量是影響苜蓿青貯效果的關(guān)鍵因素之一，青貯原料的水分含量過高，細(xì)胞液中糖分過于稀釋，不能滿足乳酸菌發(fā)酵所需要的糖濃度，水分含量過高還有利于酪酸菌進(jìn)行丁酸發(fā)酵，使青貯料變臭、品質(zhì)變差。而青貯原料的水分含量過低，抑制乳酸菌發(fā)酵，青貯產(chǎn)生乳酸的濃度降低，pH下降的速度變慢（高海娟等，2015）。研究認(rèn)為苜蓿青貯的理想含水量為40%～68%（高海娟等，2015；王根旺，2005；崔國文等，2005；聶柱山等，1990），本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)含水量的3個水平分別為65.79%、54.15%、47.03%。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同含水量對苜蓿青貯品質(zhì)的作用是B1＞B2＞B3，即含水量65.79%＞54.15%＞47.03%。

隨著貯藏時間的增加，飼料的品質(zhì)和營養(yǎng)成分在發(fā)生變化，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同貯藏時間對苜蓿青貯品質(zhì)的作用效應(yīng)是C2＞C3＞C1，即貯藏60 d＞75 d＞45 d。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，苜蓿含水量65.79%，添加纖維素酶300 g/t，貯藏60 d的青貯飼料品質(zhì)最好。3個因素對苜蓿青貯品質(zhì)的影響順序依次是貯藏天數(shù)＞原料的含水量＞添加劑。