李?，B， 周雅琳， 劉 偉， 李 雍， 秦 勇， 于蘭蘭， 陳宇涵， 許雅君，2*

（1.北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京100191；2.食品安全毒理學研究與評價北京市重點試驗室，北京 100191）

肝臟是乙醇代謝的主要器官，也是乙醇毒性的主要靶點。在肝臟中，乙醇被代謝成有毒的代謝產物乙醛，乙醛與細胞大分子（脂質和蛋白質）相互作用，激活促炎轉錄因子，誘導炎癥介質的表達，從而引起肝損傷（Jaruga等，2004）。由乙醇引起的細胞內活性氧（ROS）過量產生且不能被及時清除的氧化應激是酒精性肝病的發(fā)病機制之一（Li等，2018；李大偉等，2014；Xu 等，2014；Jin 等，2013）。 研究表明，乙醇能降低SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和GSH含量，因此，提高抗氧化能力可有效保護肝細胞免受乙醇的損傷（Sid等，2013）。氧化應激還可以引起脂質過氧化，形成具有肝毒性的MDA（Ayala等，2014）。除了ROS導致的氧化應激，乙醛誘導的炎性細胞因子也可導致過氧化產物的生成，從而引起肝臟損傷（Zhou等，2017）。

稀土元素是17種有相似原子結構和離子半徑的特殊元素的統(tǒng)稱，分為輕稀土和重稀土兩類。已有研究表明，稀土元素具有抗氧化的作用。申秀英等（2004）研究表明，低劑量釤在一定范圍內能提高SOD的活力，增強機體的抗氧化能力，對脂質過氧化反應有一定的抑制作用。夏青等（2008）研究指出，低濃度的鈰離子可減少脂質過氧化損傷。李樹蕾等（2001）研究表明，0.1 mg/kg和2.0 mg/kg的硝酸稀土可增強胃黏膜的抗氧化能力，并抑制脂質過氧化進程。屈艾等（2005）研究指出，鈥元素在一定的劑量范圍內有抗氧化損傷的作用，能增強抗氧化酶的活性。王春霞等（2000）研究表明，硝酸稀土鑭、鐠、釹、釤、鐿、釔能抑制超氧陰離子并存在劑量反應關系。作為廣泛使用的輕稀土元素，鑭是稀土元素中最具反應性的一種（Zheng等，2013），其分子結構和離子半徑與鈣離子非常相似，化學性質活潑，被稱為超級鈣，并因其毒性較低被廣泛用于農業(yè)和醫(yī)學研究。

關于硝酸鑭改善乙醇所致的急性肝損傷鮮有報道，已有的試驗也缺乏對硝酸鑭保護作用的最優(yōu)效應劑量的研究。故本試驗以硝酸鑭為研究對象，給小鼠連續(xù)灌胃30 d后，建立急性肝損傷模型，觀察不同劑量下硝酸鑭對小鼠血清ALT和AST，血清和肝臟T-SOD、GSH、MDA的影響，為探究硝酸鑭對乙醇所致的急性肝損傷小鼠的保護作用及最佳作用劑量提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 硝酸鑭 （純度≥99.99%，CAS：10277-43-7，美國 Sigma公司）。谷丙轉氨酶（ALT）測試盒 （C009-2-1）、谷草轉氨酶 （AST）測試盒（C010-2-1）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（A001-3）、谷胱甘肽（GSH）測試盒（A006-2）、丙二醛 （MDA）測試盒 （A003-1）、蛋白定量測試盒（A045-2），均購自南京建成生物工程研究所。

電子天平（SPN3001F，美國奧豪斯），電熱恒溫水浴鍋（HH·S11-1，北京長安科學儀器廠），全自動多功能酶標儀 （MULTISKAN MK3，美國Thermo），低溫自動平衡離心機（BFX5-320，白洋離心機廠），紫外分光光度計（UV-2000，美國UNIC），高速勻漿機（T18，德國 IKA 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物及飼養(yǎng)條件 健康SPF級雄性ICR 小鼠 84 只，體重（33.0±3.0）g，由北京大學醫(yī)學部試驗動物中心提供[SCXX（京）2016-0010]。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為50%～60%，晝夜照明時間為12 h:12 h。

1.2.2 試驗分組及模型建立 試驗動物適應性喂養(yǎng)5 d后，稱量其體重作為初始體重，并按體重隨機分為空白組，模型組及硝酸鑭A、B、C、D和E組 （稱取相應質量的硝酸鑭加入蒸餾水中配制而成），每組各12只。硝酸鑭A到E組分別給予相應劑量的硝酸鑭溶液灌胃，空白組和模型組經口灌胃蒸餾水，灌胃體積為0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃30 d，各組均給予維持飼料，灌胃期間自由進食和飲水。末次灌胃后，模型組和5個硝酸鑭干預組隔夜禁食 （16 h），然后一次性給予50%的乙醇12 mL/kg灌胃，6 h后殺鼠取材并檢測各項指標。試驗分組及受試樣品給予見表1。

表1試驗分組及受試樣品給予

1.2.3 測試樣品的制備 乙醇灌胃6 h后，試驗動物摘眼球取血并斷頸處死，留取血液和肝臟組織。將血液靜置1 h后，3000 r/min離心10 min，留取上清液備用。摘取的肝臟組織先在預冷的0.9%生理鹽水里漂洗并用濾紙吸干其表面水分，稱取小部分肝組織并加入其9倍體積的生理鹽水，在冰水浴中用組織勻漿機制備肝臟勻漿，3000 r/min離心10 min，留取上清液備用。

1.2.4 指標檢測

1.2.4.1 體重、食物利用率、肝臟質量和肝臟系數適應性喂養(yǎng)5 d后，對小鼠稱重，記為初始體重并根據體重隨機分組，每隔7 d在同一時間稱量小鼠體重和食物消耗量，并根據小鼠體重增量（g）和食物消耗量（100 g）計算食物利用率。稱量小鼠肝臟質量，并根據肝臟質量（g）和小鼠處死前體重（g）計算肝臟系數。

1.2.4.2 血清和肝臟組織檢測 采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測血清和肝組織的相應指標：血清ALT和AST、血清和肝臟T-SOD、GSH、MDA及肝組織蛋白含量。按照試劑盒的操作步驟對上述指標進行測定。采用微板法測定ALT和AST的活力。采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定T-SOD活力。采用比色法測定GSH含量，原理為二硫代硝基苯甲酸與硫基化合物反應時能產生一種黃色化合物，其吸光度反映了GSH的含量。用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA的含量。每個樣品重復測量三次并計算平均值。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗結果均為連續(xù)變量，以“平均數±標準差”表示。所有數據均用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析 （one-way ANOVA）比較組間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異的判斷標準。方差齊時，用SNK法進行兩兩比較；方差不齊時，用Tamhane’s法進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 體重和食物利用率 由表2和圖1可知，各組小鼠體重隨試驗時間的延長而增加，各組小鼠的體重和食物利用率均無顯著差異（P＞0.05），試驗期間，動物狀態(tài)良好，無異常表現(xiàn)，表明硝酸鑭在本試驗劑量范圍內對小鼠的生長發(fā)育無不良影響。

表2硝酸鑭對小鼠體重的影響 g

2.2 肝臟質量和肝臟系數 如表3所示，與空白組相比，模型組肝臟質量和肝臟系數顯著增加（P＜0.01），說明乙醇會導致小鼠肝臟受損，組織腫脹。與模型組相比，硝酸鑭各劑量組肝臟質量均有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，硝酸鑭各劑量組小鼠肝臟系數均有不同程度的降低，其中硝酸鑭E組顯著降低（P＜0.05），降低0.67%，說明一定劑量的硝酸鑭能有效抑制乙醇所致的肝臟腫大。

表3 硝酸鑭對小鼠肝臟質量和肝臟系數的影響

2.3 硝酸鑭對小鼠血清ALT和AST的影響 如表4所示，模型組小鼠血清中ALT和AST含量明顯增加，與空白組相比差異極顯著（P＜0.01），表明乙醇所致小鼠肝損傷模型建立成功。經硝酸鑭干預后，各組小鼠ALT相比模型組均有不同程度的改善，其中以硝酸鑭C、E組的效果最好 （P＜0.05 或P＜ 0.01），分別降低 23.58、21.07 U/L，各組小鼠AST相比模型組均有不同程度的改善，其中以硝酸鑭C、D、E組的效果最好 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低 52.56、43.83、28.54 U/L，表明硝酸鑭能顯著改善乙醇所致急性肝損傷小鼠的肝功能。

表4 硝酸鑭對小鼠血清ALT和AST的影響U/L

2.4 硝酸鑭對小鼠T-SOD活力的影響 如表5所示，與空白組相比，模型組血清和肝臟中TSOD活力極顯著降低（P＜0.01），提示乙醇能降低小鼠體內抗氧化酶的活性。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預組T-SOD活力逐漸增強，其中硝酸鑭B、C、D、E組血清中T-SOD活力極顯著增強（P＜ 0.01），分別增加 27.53、38.74、48.01、53.96 U/mL， 硝酸鑭 C、D、E 組肝臟中 TSOD活力顯著增強（P＜0.05或P＜0.01），分別增加 15.87、18.6、17.78 U/mg prot。

表5 硝酸鑭對小鼠T-SOD活力的影響

2.5 硝酸鑭對小鼠GSH含量的影響 如表6所示，與空白組相比，模型組血清GSH含量極顯著降低（P＜0.01），肝臟GSH含量有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），提示乙醇能降低小鼠體內抗氧化物質的含量。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預組血清GSH含量逐漸升高，且在D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜ 0.01），分別增加 5.94、7.86 μmol/L。 肝臟中GSH含量呈現(xiàn)出和血清GSH含量相似的變化趨勢，且在硝酸鑭E組中顯著升高 （P＜0.05），增加 0.83 μmol/g prot。

表6 硝酸鑭對小鼠GSH含量的影響

2.6 硝酸鑭對小鼠MDA含量的影響 如表7所示，與空白組相比，模型組血清和肝臟中MDA含量顯著增加（P＜0.05），提示乙醇能增加小鼠體內脂質過氧化物的含量。與模型組相比，多數硝酸鑭干預組的血清MDA含量表現(xiàn)出下降趨勢，且在D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異（P＜0.01），分別降低4.13、4.41 nmol/mL。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預組肝臟MDA含量逐漸降低，其中硝酸鑭E組MDA含量顯著降低（P＜0.05），降低 0.64 nmol/mg prot。

表7 硝酸鑭對小鼠MDA含量的影響

3 討論

ROS是機體正常代謝過程的產物，線粒體是其重要來源，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基以及一氧化氮等 （Afonso等，2019）。適量的ROS為人體生命活動和組織細胞生長代謝所必需，但過量的ROS會損傷抗氧化系統(tǒng)，導致脂質過氧化，并降低GSH和SOD；還能導致DNA損傷和線粒體功能障礙（Wang等，2019）。這些改變最終會導致組織損傷和細胞凋亡，損傷可發(fā)生在各種臟器，如肝、腎、肺等（Xin 等，2019）。 細胞內超量的過氧化物會引起內質網應激，最終導致蛋白質翻譯后修飾異常。乙醇介導的氧化應激已被證實與酒精性肝病、中樞神經系統(tǒng)異常、酒精性胃病和發(fā)育障礙等密切相關，其分子機制可能與刺激線粒體產生更多的超氧陰離子和過氧化氫，導致肝細胞脂質過氧化有關（左瑋等，2018；Altamirano等，2011）。乙醇也可誘導紅細胞產生氧化應激，在與多不飽和脂肪酸的共同作用下，乙醇在代謝過程中產生的過量自由基會進一步增加，這些超氧基團可能通過血液循環(huán)損傷其他器官或組織 （王榮榮等，2019）。

ALT和AST是評價肝臟是否受損的兩個重要的生化指標。正常情況下，ALT和AST在血清中的含量較低，而當肝臟受損時，大量ALT和AST釋放入血，引起血清中這兩種酶活性明顯升高，表明肝臟中細胞滲漏和細胞膜功能完整性喪失 （Fujiwara等，2013；Neuman 等，2013；Zeng 等，2013；Yan 等，2007；Lin 等，2004）， 其在血液中的水平也是臨床檢驗肝功能的重要指標之一。本研究中，模型組小鼠血清中ALT和AST活性顯著升高，表明乙醇能造成小鼠的急性肝損傷。與模型組相比，部分硝酸鑭干預組小鼠血清ALT和AST顯著降低，表明硝酸鑭具有一定的護肝作用。

SOD能阻止自由基啟動脂質過氧化進程，是ROS清除過程中發(fā)揮作用的第一種抗氧化酶，能保護細胞免受氧化損傷，其活力反映了機體清除氧自由基的能力，在清除過氧化氫、超氧陰離子和羥自由基中發(fā)揮關鍵作用（石敏娟等，2019；Wang等，2019）。本研究中，與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預組小鼠的T-SOD活力逐漸升高，并在大部分干預組的血清和肝臟中表現(xiàn)出顯著差異，提示硝酸鑭能通過增強小鼠體內抗氧化酶的活性而發(fā)揮護肝作用。

GSH是重要的低分子巰基抗氧化劑，在生物系統(tǒng)中主要以還原形式存在，也是GPX和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）的重要輔因子，其功能的發(fā)揮取決于半胱氨酰殘基的硫醇基數量，與多種外源性和內源性氧化劑的解毒有關，在氧化應激中起保護作用（Adriana 等，2020；Farina 等，2019）。 本研究中，與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預組小鼠血清和肝臟GSH含量逐漸升高，并在硝酸鑭D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異，表示硝酸鑭可通過增加小鼠體內抗氧化物質的含量而減輕肝損傷。

MDA是不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應生成的終末產物之一，其含量可以間接反映膜脂質氧化的受損程度 （王艷婕等，2019；Gao等，2017）。也有研究表明，ROS和MDA存在劑量反應關系（Chen等，2019）。MDA是肝臟脂質過氧化的生物標志物（Li等，2015），是間接評價保肝藥物療效的生化指標 （Sreelatha等，2009）。本研究中，與模型組相比，多數硝酸鑭干預組的血清和肝臟MDA出現(xiàn)下降，且在部分硝酸鑭干預組中表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異，表示硝酸鑭可通過減少脂質氧化終產物的含量而發(fā)揮對急性肝損傷小鼠的保護作用。

黃可欣（2003）和李冬梅（2008）等的研究表明，低劑量硝酸鑭能適當提高機體的抗氧化能力，并認為稀土的生物學效應與劑量大小有關，小劑量有刺激作用而大劑量則有抑制作用。劉穎等（2001）研究指出，一定劑量的硝酸鑭可以升高SOD和GPX，降低MDA含量。本研究結果表明，硝酸鑭能提高乙醇所致急性肝損傷小鼠的抗氧化能力，對小鼠肝臟存在一定的保護作用，這與以往的研究結果一致。

4 小結

本試驗結果表明，硝酸鑭能通過降低小鼠血清ALT和AST的活性，提高其體內抗氧化酶的活性，清除體內自由基和降低氧化應激產物含量而發(fā)揮保護肝細胞的作用并恢復肝功能，本試驗條件下，最佳保護作用劑量為1.0 mg/kg和2.0 mg/kg。