林 淼， 張世杰， 葛紅帆， 張 蒙， 鞏 帥

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

亞硝酸鹽是瘤胃硝酸鹽還原的中間產物，目前對亞硝酸鹽的關注多集中在過量亞硝酸鹽導致機體中毒（Cockburn等，2013）。但是確定亞硝酸鹽對瘤胃發(fā)酵的影響及其調控因素具有重要的價值。Asanuma等（2015）報道，硝酸鹽易在瘤胃內被還原為亞硝酸鹽進而生成氨。Wang等 （2018）研究表明，硝酸鹽和亞硝酸鹽可提高瘤胃微生物蛋白的合成量。但是，亞硝酸鹽還原為氨比硝酸鹽還原為亞硝酸鹽需要更多的電子（Latham等，2016；Iwamoto 等，2001）。 Latham 等（2016）報道，氫（H+）是亞硝酸鹽還原的必需電子供體，同時供氫體是日糧碳水化合物發(fā)酵的產物。丁?。?003）研究表明，日糧精粗比為8：2時，瘤胃微生物活性及發(fā)酵水平較高。同時，高精粗比改變了瘤胃體外發(fā)酵參數，顯著提高了氨態(tài)氮的利用率（陳志龍等，2016；何玉鵬等，2014）。 林淼等（2014）報道，NDF:NFC=0.71時，最有利于湖羊瘤胃還原硝酸鹽。Sakthivel等（2012）研究表明，高精粗比可促進硝酸鹽的還原。由于飼喂亞硝酸鹽存在中毒風險，體外培養(yǎng)就成為研究亞硝酸鹽瘤胃發(fā)酵的主要手段。然而，關于瘤胃體外長期培養(yǎng)的發(fā)酵模式是否發(fā)生變化的研究較少。同時，不同精粗比對亞硝酸鹽的體外瘤胃發(fā)酵的影響鮮見報道。因此，本試驗選用玉米和苜蓿為發(fā)酵底物配合成不同精粗比，研究其對長期體外傳代培養(yǎng)的亞硝酸鹽還原的影響，為探索調控亞硝酸鹽瘤胃還原提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計 采用雙因素雙水平試驗設計，選取2頭體況良好，安裝永久性瘤胃瘺管的湖羊作為瘤胃液供體動物。動物的全混合日糧精粗比為6：4，飼糧組成為玉米20%，豆粕6%，玉米酒精糟7%，豆皮20%，燕麥草20%，大豆油1%，小蘇打1%，預混料5%。飼糧粗蛋白質含量為14.12%，消化能為9.26 MJ/kg，中性洗滌纖維含量為30.14%。每天飼喂三次 （07:30、14:30和20:30），自由飲水。晨飼后5 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃內容物，經4層紗布過濾，迅速帶回實驗室進行體外培養(yǎng)。

1.2 體外發(fā)酵底物 將玉米和苜蓿粉碎過1 mm篩，分裝，廣口瓶貯存?zhèn)溆?。發(fā)酵底物組成如下：

LC：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿；LC-N：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿+亞硝酸鉀 （終濃度10 mmol/L）；HC：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿；HC-N 底物：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿+亞硝酸鉀（終濃度10 mmol/L）。各設置3個平行。試驗所用亞硝酸鉀購自上海滬試。

1.3 體外培養(yǎng)方法 稱取底物，分別轉移入厭氧瓶，加入15 mL培養(yǎng)液和2 mL的瘤胃發(fā)酵液，持續(xù)通無氧CO2，密封后記錄初始氣壓，并放入39℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，視為一代。在培養(yǎng)24 h之后，取出厭氧瓶，記錄末氣壓；開蓋吸取2 mL培養(yǎng)液，傳代入新鮮培養(yǎng)基中，密封記錄下一代的初期氣壓，放入39℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。整個接種和傳代過程，必須保證厭氧。

每次傳代前測定發(fā)酵液pH，并每培養(yǎng)30代采集一次樣本，備測NO2-、NH3-N及TVFA濃度。30代結束后玉米苜蓿比例由1:3更換為3:1，即用底物HC替換底物LC，用底物HC-N替換底物LC-N，繼續(xù)培養(yǎng)至第30代結束；測定指標同上。

1.4 樣品的采集與分析 在培養(yǎng)的相應代次采集2 mL發(fā)酵液，置于-20℃保存?zhèn)錅y。樣本液解凍后離心（12000 r/min，20 min），保留上清液，按照1:5的比例加入25%的偏磷酸，冷凍過夜；再取出解凍后離心（12000 r/min，20 min）。 將此去蛋白后的上清液分成三份，分別用于測定NO2-、NH3-N和VFA的含量。NO2-濃度采用比色法（南京建成生物工程研究所試劑盒）；NH3-N濃度采用酚-次氯酸鈉比色法（Broderick 等，1980）；VFA濃度采用日本島津GC-14B氣相色譜儀測定 （林淼等，2010）。

1.5 統(tǒng)計分析 產氣量按以下公式計算：

V x=Vj×Ppsi×0.068004084；

式中：Vx為39℃時的產氣量，mL；Vj為發(fā)酵瓶內氣體的體積，mL；Ppsi為一定時刻發(fā)酵瓶內的氣壓，psi。

試驗數據采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件中的MIXED進行方差分析，以Tukey做兩兩比較，結果以“平均值”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 長期培養(yǎng)的體外發(fā)酵產氣量和pH變化規(guī)律 不同玉米：苜蓿比例各培養(yǎng)30代的產氣量和發(fā)酵液pH見圖1。在培養(yǎng)30代后，兩個精粗比的體外產氣量和pH均達到穩(wěn)定，且標準誤減少。添加亞硝酸鉀降低了發(fā)酵產氣量，升高了發(fā)酵液pH。

2.2 不同精粗比條件下添加亞硝酸鉀對發(fā)酵參數的影響 由表1可知，LC-N組產氣量顯著低于LC組和LC-N組（P＜0.01），LC組和HC組體外產氣量無顯著差異；亞硝酸鉀和玉米苜蓿比例間存在交互作用。發(fā)酵液pH的變化規(guī)律為LC-N組＞LC組＞HC組＞HC-N組（P＜0.01）。各組發(fā)酵液NO2-濃度均無顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵液NH3-N濃度變化規(guī)律為LC-N組＞HC-N組＞LC組＞HC組（P＜0.01）；亞硝酸鉀和玉米苜蓿比例間存在交互作用。發(fā)酵液TVFA產量以LC組和HC組最高，HC-N組次之，LC-N最低（P＜0.01）。此外，LC組的乙酸比例顯著高于其他各組，而丙酸比例顯著低于其他各組（P＜0.01）；丁酸比例各組間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同玉米∶苜蓿比例下添加亞硝酸鉀對體外發(fā)酵參數的影響

3 討論

3.1 長期培養(yǎng)的體外發(fā)酵產氣量和pH變化規(guī)律 Martinez等（2010）報道，與飼喂相同飼料的瘤胃液供體羊相比，體外發(fā)酵16 d后，自動核糖體基因間隔分析（ARISA）結果表明，未檢測到特異性細菌群落的變化；而Zapletalova等（2016）證明了利用雙外流連續(xù)培養(yǎng)技術，在接種瘤胃內容物10 d內，發(fā)酵液SCFA產量和pH與瘤胃內相似，但瘤胃細菌群落結構發(fā)生了變化，并且此變化歸因于該生物反應器中氧化還原電位的下降。出現不同結果的原因可能是選用了不同的發(fā)酵底物和培養(yǎng)模式。本試驗以玉米和苜蓿為發(fā)酵底物，采用每日傳代的方式實現30 d的連續(xù)培養(yǎng)，通過檢測產氣量和發(fā)酵液pH發(fā)現，體外產氣量和pH在傳代至20代之后趨于穩(wěn)定，說明本試驗培養(yǎng)30代時的數據較合理，可用于發(fā)酵參數的比較分析。

3.2 不同精粗比條件下添加亞硝酸鉀對發(fā)酵參數的影響 日糧精粗比對瘤胃內環(huán)境、瘤胃發(fā)酵水平和微生物活性及區(qū)系都有一定的影響。本試驗主要對發(fā)酵液的產氣量、pH及NO2-、NH3-N、VFA濃度五個指標進行了測定和比較。目前對亞硝酸鹽的研究多集中在病理學方面，鮮有關于直接添加亞硝酸鹽對瘤胃發(fā)酵影響的報道。不同精粗比條件下發(fā)酵液中的NO2-24 h濃度無顯著變化，說明精粗比不影響亞硝酸鹽的體外還原。Lin等（2013）體外選用 2：8 和 8：2 的精粗比，添加硝酸鹽后發(fā)現體外產氣量顯著降低，這與本試驗精粗比為1：3的產氣量規(guī)律相同。但本試驗隨著玉米比例的升高，亞硝酸鉀對體外產氣量無顯著影響，該結果與前人研究結果不同。

無論是否添加亞硝酸鉀，本試驗精粗比為1：3的pH顯著高于精粗比為3：1，這與楊靖等（2019）研究結果一致。本試驗中精粗比為1：3底物添加亞硝酸鉀顯著提高了發(fā)酵液pH，這與前人研究結果一致。Zhao等（2015）選用精粗比為3：7的肉牛日糧中添加硝酸鹽發(fā)現瘤胃pH升高。陳志遠等（2016）選用精粗比為6：4的日糧研究湖羊日糧中添加硝酸鹽后瘤胃發(fā)酵的變化，結果表明pH顯著升高。Wang等（2018）在精粗比為5：5的奶牛日糧中添加硝酸鹽發(fā)現瘤胃pH顯著升高。相反的是，本試驗發(fā)現精粗比3：1底物添加亞硝酸鉀顯著降低了發(fā)酵液pH，該結果與前人研究結果不同。

本試驗添加亞硝酸鉀顯著提高發(fā)酵液的NH3-N含量，這與前人研究結果一致（陳志遠等，2016；Zhao 等，2015；Lin 等，2013），表明亞硝酸鉀可作為瘤胃細菌有效的非蛋白氮來源。而無論是否添加亞硝酸鉀，NH3-N含量隨玉米比例的升高而下降。有研究表明，山羊日糧精粗比為8：2時，細菌15N的富集量最高（趙國琦等，2004）。類似的研究在犢牛上表明，精粗比為6：4的日糧氨態(tài)氮濃度顯著高于精粗比為5：5時 （鄒新平等，2015）。推測快速發(fā)酵碳水化合物含量高時，可提高氨態(tài)氮的利用效率。

本試驗中，當精粗比由1:3提高為3:1后，乙酸含量下降，丙酸含量升高。梁靜等（2016）的體外培養(yǎng)結果選用了精粗比為 3：7、4：6、5：5、6：4 和7：3，得出與本試驗相似的結果。當日糧中精料比例增加時，乙酸濃度顯著降低，丙酸濃度顯著升高（Zhao等，2015）。高精料日糧中可發(fā)酵碳水化合物含量較多時，丙酸產量提高，發(fā)生的是丙酸發(fā)酵（丁健，2003）。因此，試驗中當增加了玉米用量后，丙酸產量隨之上升。當精粗比1∶3時添加亞硝酸鉀TVFA產量顯著降低，乙酸比例降低，丙酸比例升高；但選用發(fā)酵底物精粗比3∶1時，添加亞硝酸鉀不改變體外產氣量、TVFA產量、乙酸和丙酸比例，這說明亞硝酸鉀改變了瘤胃發(fā)酵類型。

4 結論

在本試驗條件下，提高底物精粗比，降低了發(fā)酵液pH、氨態(tài)氮和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度以及乙酸的比例，但升高了丙酸的比例；與高精粗比底物相比，在低精粗比底物中添加10 mmol/L亞硝酸鉀顯著降低了產氣量和總揮發(fā)性脂肪酸產量，提高了發(fā)酵液pH、氨態(tài)氮濃度；高精粗比更適合于亞硝酸鹽的瘤胃發(fā)酵。