張 野 楊 楠 劉 洋 唐中華 郭曉瑞 王洪政*

(1.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

黃芪為我國常用傳統(tǒng)中草藥，記載自《神農本草經》[1～2]。根據最新藥典規(guī)定，黃芪的原植物為豆科黃芪屬多年生草本植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)及其變種蒙古黃芪(A.membranaceusBge. var.mongholicusHsiao)[3]。黃芪中含有黃酮類、皂苷類及多糖類等多種藥用活性成分[3]。藥理學研究表明，黃芪具有補氣升陽、固表止汗、延緩衰老、增強機體免疫力等功效[4]。近年來，隨著中藥材市場對黃芪需求量的急劇增加，黃芪野生資源遭到嚴重破壞，目前90%以上的黃芪來源于人工培育[5]，人工種植的黃芪主要分布在我國黑龍江、甘肅、山西、河北等地[5]。

種植地礦物質營養(yǎng)狀況與黃芪生長發(fā)育及活性物質含量密切相關。已有研究結果表明，增施氮、磷、鉀肥對黃芪根系和地上部的生長發(fā)育都有促進作用，并且施用鉀肥可以明顯提高黃芪的抗病能力[6]。當對黃芪幼苗進行缺素處理培養(yǎng)時，氮、磷、鉀素的缺乏嚴重影響了黃芪根系活力并降低了葉綠素含量[7]。此外，在生長季施加氮肥顯著增加了黃芪初生代謝和次生代謝的強度，提高了根部總黃酮的含量[8]。

硫(S)是植物生長發(fā)育所必需的第四大營養(yǎng)元素[9]，它在植物生長發(fā)育和代謝調控過程中具有重要作用[10]。目前，隨著土壤硫元素淋溶損失，空氣硫沉降降低以及含硫肥料使用量的減少，我國多地土壤都有缺硫的報道[11]。豆科植物是需硫量較高的植物，如大豆缺硫時，葉片失綠，葉緣兩側呈棕色斑點、植株矮小、根瘤發(fā)育遲緩，導致大豆成熟期延遲、結籽量下降[12]。作為優(yōu)質黃芪主產區(qū)的我國東北和西北部地區(qū)，土壤硫元素的缺乏情況也非常嚴重，特別是東北地區(qū)土壤的缺硫情況最為嚴重，據統(tǒng)計，其缺硫土壤面積占全省耕地面積的60%以上[13]。但目前關于黃芪對硫營養(yǎng)供應缺乏的生理響應相關的研究在國內外還較為少見。

本研究以藥典規(guī)定的兩種黃芪藥材原植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的幼苗為實驗材料，在水培條件下研究了黃芪幼苗在不同程度缺硫情況下生長形態(tài)指標、光合及活性物質積累等方面發(fā)生的變化，探討黃芪幼苗面對缺硫脅迫時的生理響應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge，以下簡稱A.membranaceus)和蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao，簡稱A.membranaceusvar.mongholicus)為實驗材料。兩種黃芪的種子均購買自河北省安國市元泰藥用植物種子站。毛蕊異黃酮苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、刺芒柄花素(Formononetin)和刺芒柄花苷(Ononin)和標準品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈購于北京百靈威化學有限公司，去離子水(電阻率高于18.2 mΩ·cm-1)取自Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪幼苗培養(yǎng)及缺硫處理過程

精選籽粒飽滿的膜莢黃芪和蒙古黃芪的種子，用10%次氯酸鈉溶液浸泡15～20 min消毒后，再用去離子水沖洗4～5次。室溫浸泡24 h，播種到蛭石中。7 d后待幼苗子葉完全展開，選取長勢相近的幼苗，移植到Hoagland營養(yǎng)液(pH5.5)中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25～30℃；每天光照14 h，光照強度為400 μmol·m-2·s-1；相對濕度保持在70%左右；每3 d更換1次培養(yǎng)液。溶液培養(yǎng)21 d后進行不同程度缺硫處理，設置全營養(yǎng)液(Control，CK，硫濃度為2 mmol·L-1)、低硫(Low sulfur application，LS，硫濃度為1 mmol·L-1)和無硫(No sulfur application，NS)3個處理，NS處理中所有硫酸鹽全部使用其對應的氯化鹽替代。每處理設3個重復，每個重復包括10株幼苗。處理進行15 d后對幼苗進行拍照和取樣分析。

1.2.2 生長指標的測定

在處理前后分別用直尺(精度為1 mm)測量黃芪幼苗的株高和根長并記錄用于計算處理期間株高生長量和根伸長量。

處理結束后，將黃芪植株的根、莖、葉進行分離，去除表面水分后稱重記各部分鮮重，然后將樣品放入烘箱中110℃殺青10 min并60℃烘干48 h，稱重記各部分干重。

1.2.3 葉綠素含量測定

使用張憲政的方法[14]采用丙酮—無水乙醇混合液進行浸提并測定葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

1.2.4 葉片熒光參數(shù)的測定

利用便攜式調制葉綠素熒光儀(WALZ，PAM-2500，Germany)測定黃芪葉片熒光參數(shù)。選取幼苗頂端第五片展開葉，經15 min暗適應后，測量初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、Fv′/Fm′、非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)等熒光參數(shù)。每個處理重復測量5次，取平均值。

1.2.5 MDA含量測定

黃芪植株各部位組織MDA的含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行測定[15]。

1.2.6 總酚和總黃酮含量測定

總酚含量參考許海棠等的方法[16]進行測定，總黃酮含量參考聶靜苑等的方法[17]進行測定。

1.2.7 異黃酮含量的測定

處理結束后取黃芪幼苗根、莖、葉3個部位新鮮樣品各1 g，加入70%甲醇8 mL，在40℃下超聲提取45 min，過濾后的濾渣再次加入8 mL甲醇溶液超聲提取，合并兩次提取液。使用真空離心濃縮儀將提取液濃縮至干后，用1 mL 70%色譜級甲醇復溶樣品，取上清液使用LC-MS系統(tǒng)測定其中異黃酮含量。色譜條件和質譜條件參考楊楠等的方法[18]進行。

1.3 數(shù)據分析

應用SPSS19.0軟件對所有實驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析檢驗不同處理下指標的差異顯著性(P<0.05)。采用SigmaPlot軟件(14.0，Systat Software)繪制圖表。

圖1 不同缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪形態(tài)的影響 不同小寫字母表示差異顯著P<0.05，下同。Fig.1 Morphologic effects of different degrees of sulfur deficiency on seedlings of A.membranaceus and A.membranaceus var. mongholicus Different lowercase letters indicate significant difference at P< 0.05 level,the same as below.

表1 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗生物量的影響

Table 1 Effects of different degrees of sulfur deficiency on biomass ofA.membranaceusandA.membranaceusvar.mongholicus

項目Terms處理Treatments膜莢黃芪A.membranaceus蒙古黃芪A.membranaceusvar.mongholicus根Roots莖Stems葉Leaves全株Total根Roots莖Stems葉Leaves全株Total鮮重Freshweight(g)CK11.12a?7.63a12.43a31.18a10.42a3.79a7.16a21.37aLS9.03a3.31b8.03b20.37b8.34a1.43b4.38b14.15bNS6.53b1.15c5.88c13.56c8.48a1.55b3.13b13.16b干重Dryweight(g)CK1.48a1.79a2.97a6.25a1.16a0.91a1.55a3.62aLS1.09b0.84b2.20b4.12b0.82b0.40b1.13b2.34bNS1.22b0.47b1.82b3.31c0.78b0.45b0.84b2.07b

注：*小寫字母不同表示同種黃芪在不同處理間指標差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:*different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level,the same as below.

表2 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

Table 2 Effects of different degrees of sulfur deficiency on fluorescence parameters ofA.membranaceusandA.membranaceusvar.mongholicusseedlings

黃芪種類Variety處理Treatment熒光參數(shù)PhotosyntheticparameterFmFoFv′/Fm′Y(Ⅱ)Y(NPQ)Y(NO)Y(NPQ)/Y(NO)ETR膜莢黃芪A.membranacusCK 2.18a?0.48a0.78a0.09a0.54a0.37a1.49a29.5aLS1.74b0.46a0.74b0.08a0.61b0.31b1.93b26.9aNS1.55b0.47a0.69c0.04b0.62b0.34ab1.84ab13.5b蒙古黃芪A.membranacusvar.mongholicusCK2.54a0.44a0.83a0.39a0.34a0.27b1.28a23.3aLS2.27b0.44a0.81b0.38a0.40b0.22a1.85ab22.5aNS1.98c0.45a0.77c0.19b0.55c0.26b2.17b11.27b

2 結果與分析

2.1 缺硫處理對黃芪幼苗形態(tài)的影響

低硫和無硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗生長產生了明顯的負面影響。從圖1可以看出，缺硫條件下，特別是無硫條件下，兩種黃芪幼苗植株高度明顯變矮，復葉葉序數(shù)減少，葉片黃化，特別是老葉失綠嚴重，根系發(fā)生褐變現(xiàn)象。對處理期間黃芪幼苗根系和株高伸長生長數(shù)據分析后發(fā)現(xiàn)，低硫處理后，膜莢黃芪和蒙古黃芪的株高生長量和根系伸長量均顯著低于對照，表明缺硫處理顯著抑制了黃芪幼苗的伸長生長(見圖1)。在無硫處理下，膜莢黃芪株高生長及蒙古黃芪根系伸長生長的受抑制程度進一步加強。與膜莢黃芪相比，無硫處理下蒙古黃芪地上部生長受抑制情況稍好于膜莢黃芪，其株高生長受抑制率比膜莢黃芪降低了5.61%。

2.2 缺硫處理對黃芪幼苗生物量的影響

缺硫處理除了可以抑制黃芪幼苗根系和地上部伸長生長外，還顯著降低了黃芪幼苗的生物量累積水平(見表1)。從全株來看，低硫處理下膜莢黃芪幼苗鮮重和干重分別比對照降低了35.7%和34.1%，相同條件下蒙古黃芪幼苗鮮重和干重則分別降低了33.8%和35.4%。無硫處理下，蒙古黃芪幼苗生物量的受影響程度明顯低于膜莢黃芪，兩者的鮮重和干重分別比其對照下降了38.4%、42.8%以及56.5%和47.1%。從根、莖、葉各部分來看，不同程度缺硫處理對其生物量影響的大小順序依次為：莖>葉>根。

圖2 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪葉片光合色素含量的影響Fig.2 Effects of different degrees of sulfur deficiency on photosynthesis pigment contents of A.membranaceus and A.membranaceus var. mongholicus leaves

圖3 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗丙二醛含量Fig.3 Effects of different degrees of sulfur deficiency on MDA contentsof A.membranaceus and A.membranacus var. mongholicus seedlings

2.3 缺硫對黃芪幼苗葉片光合色素含量和熒光參數(shù)的影響

缺硫處理嚴重影響了兩種黃芪幼苗成熟葉片中光合色素的含量(見圖2)。與各自對照相比，低硫處理下，膜莢黃芪和蒙古黃芪葉片中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量都下降了30%以上；無硫處理下，除葉綠素b外，其余光合色素含量均下降了70%以上。此外，低硫處理對兩種黃芪葉片光合色素含量的影響水平相近，而無硫處理對蒙古黃芪光合色素含量的影響程度則稍大于膜莢黃芪。

缺硫處理引起了兩種黃芪幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的明顯變化(見表2)。與正常硫供應相比，低硫處理引起了最大熒光產量Fm及光系統(tǒng)Ⅱ有效光化學效率Fv′/Fm′的顯著降低。無硫處理除了引起上述兩個熒光參數(shù)的降低外，還引起了光系統(tǒng)Ⅱ有效量子產量Y(Ⅱ)和電子傳遞速率ETR的大幅度降低，膜莢黃芪和蒙古黃芪中兩個參數(shù)都比對照降低了50%以上。與上述熒光參數(shù)不同，調節(jié)性能量耗散的量子產量Y(NPQ)受缺硫處理影響而顯著升高。與膜莢黃芪可以在低硫處理下提高了光保護能力Y(NPQ)/Y(NO)相比，蒙古黃芪則可以在無硫處理下更好地提高葉片在過剩光下的自我保護能力。

2.4 缺硫對黃芪幼苗膜脂過氧化水平的影響

從圖3可以看出，低硫處理使得兩種黃芪根、莖、葉各部位MDA含量都發(fā)生了顯著升高，并且隨著缺硫情況的加重，根系和莖中的MDA含量進一步增加。與對照相比，無硫條件下膜莢黃芪三個部位的MDA含量分別升高了73.5%、58.0%和67.0%。相對而言，在低硫和無硫處理后，蒙古黃芪莖中MDA含量的增加程度稍高于膜莢黃芪，而葉片中MDA含量的增加程度卻都遠遠低于膜莢黃芪。

2.5 缺硫對黃芪幼苗總酚和總黃酮含量的影響

作為植物體內一類重要的抗氧化物質成分，酚類的合成在膜莢黃芪和蒙古黃芪根、莖和葉中均受到了缺硫處理的嚴重抑制(見表3)。在蒙古黃芪中，低硫處理即使得其根、莖、葉中的總酚含量分別降低了43.2%、49.8%和42.3%，在無硫情況下三個部位總酚含量進一步下降。與蒙古黃芪相似，低硫和無硫處理也引起了膜莢黃芪根、莖和葉三個部位總酚含量的顯著降低，但其降低程度均稍低于蒙古黃芪。

表3 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗總酚和總黃酮含量的影響

Table 3 Effects of different degrees of sulfur deficiency on total phenol and flavonoid contents ofA.membranaceusandA.membranacusvar.mongholicusseedlings

項目Term處理Treatment膜莢黃芪A.membranaceus蒙古黃芪A.membranacusvar.mongholicus根Roots莖Stems葉Leaves根Roots莖Stems葉Leaves總酚Totalphenols(μg·g-1FW)CK1053a?2386a4147a1855a2345a3417aLS939ab1730b3189b1053b1178b1970bNS793b1417c2261c741c1032c1065c總黃酮Totalflavonoids(μg·g-1FW)CK373b426a452a256a133a598aLS471a234b366b171b215b427bNS295c176c285c113c319c258c

圖4 不同程度缺硫處理對膜莢黃芪和蒙古黃芪4種異黃酮成分含量的影響Fig.4 Effects of different degrees of sulfur deficiency on contents of the four isoflavones in A.membranaceus and A.membranacus var. mongholicus seedlings

黃酮類物質是一類以2-苯基色原酮為框架的多酚。我們發(fā)現(xiàn)，在缺硫條件下，其在黃芪幼苗各部位的合成和積累也受到了與酚類相似的影響(見表3)。與酚類不同的是，低硫情況下膜莢黃芪根系中總黃酮含量出現(xiàn)了升高情況。此外，無論是低硫還是無硫處理，蒙古黃芪莖中黃酮含量均出現(xiàn)了明顯升高，并且無硫條件下其升高幅度更大。與對照相比，無硫處理下蒙古黃芪莖中黃酮含量升高了近1.4倍。

2.6 黃芪4種黃酮類活性成分積累水平

毛蕊異黃酮、刺芒柄花素及其苷類是黃芪中重要的異黃酮類物質。從圖4可以看出，在葉片中，與總黃酮的變化規(guī)律不同，缺硫處理引起了毛蕊異黃酮和刺芒柄花素含量的普遍升高，而且除低硫條件下刺芒柄花素外，不同情況缺硫時蒙古黃芪葉片中4種異黃酮的升高幅度均明顯高于膜莢黃芪。在莖中，膜莢黃芪毛蕊異黃酮及其苷類的含量在缺硫條件下顯著降低，刺芒柄花素及其苷類的含量則與此相反。值得注意的是，無硫條件下蒙古黃芪莖中毛蕊異黃酮苷的含量出現(xiàn)了急劇升高，與對照相比，其含量升高了4倍以上。在膜莢黃芪根系中，除了毛蕊異黃酮苷含量受缺硫誘導有所降低外，其余3種異黃酮含量均受缺硫誘導而明顯升高；在蒙古黃芪根系中，除低硫處理下毛蕊異黃酮含量稍有降低外，所有異黃酮含量都因缺硫處理而升高，而且在無硫處理下毛蕊異黃酮和刺芒柄花素苷含量的升高幅度均大于膜莢黃芪。

3 討論

硫是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，是構成氨基酸和蛋白質的重要組分，也是多種生物酶的活性中心[19]。缺硫條件下植物的生長發(fā)育會受到阻礙，出現(xiàn)葉片失綠、植株矮小、根系不發(fā)達[20～21]。豆科植物是需硫量較高的植物，因此對硫缺乏的反應比較敏感。在本研究中，膜莢黃芪及其變種蒙古黃芪在缺硫條件下根系和地上部伸長生長受到嚴重抑制，鮮重和干重明顯降低，葉片失綠明顯，表明實驗所設的缺硫條件顯著影響了兩種黃芪的生長發(fā)育。硫酯是葉綠體膜的重要組分之一，硫代謝與葉綠素的關系非常密切，缺硫能使植物葉綠素含量降低，光合作用下降[22]，這也是缺硫引起植物生長受阻的重要原因。我們發(fā)現(xiàn)，缺硫脅迫下兩種黃芪葉片所有光合色素含量均出現(xiàn)了大幅下降，特別是無硫處理后絕大多數(shù)光合色素含量下降了70%以上。光合色素含量的下降使得捕獲和傳遞給PSⅡ反應中心的光能減少，引起植株凈光合速率降低[23]。與此相一致，本實驗中低硫和無硫處理下兩種黃芪最大熒光產量Fm、光系統(tǒng)Ⅱ有效光化光效率Fv′/Fm′、有效量子產量Y(Ⅱ)和電子傳遞速率ETR均出現(xiàn)了明顯下降。有研究認為，缺硫導致的包括半胱氨酸和鐵硫中心等含硫蛋白的合成受阻，是缺硫引起ETR下降的主要原因[23]。

不同植物種類抵抗缺硫脅迫的能力不同，比如楊樹抵抗缺硫脅迫的能力強于十字花科植物[24]。本研究中，在缺硫特別是無硫條件下，蒙古黃芪地上部生長、全株生物量等方面明顯優(yōu)于膜莢黃芪，表明蒙古黃芪比膜莢黃芪對缺硫脅迫表現(xiàn)出了更強的抵抗能力。在水稻中，發(fā)現(xiàn)無硫條件下調節(jié)性能量耗散的量子產量，研究者認為非光化學能量耗散有助于保護PSⅡ，是水稻植株適應缺硫脅迫的一種生理機制[25]。我們的實驗結果顯示，在低硫或無硫處理下，兩種黃芪調節(jié)性能量耗散的量子產量Y(NPQ)以及光保護能力Y(NPQ)/Y(NO)都高于對照，而蒙古黃芪在無硫條件下的光保護能力更為明顯，表明非光化學能量耗散能力的提高可能是蒙古黃芪更好適應缺硫脅迫的一個重要原因。較高的光保護能力可以有效減少缺硫脅迫下因光電子傳遞效率超氧陰離子降低而引起的活性氧產生[26]，從而減輕了缺硫脅迫誘導的蒙古黃芪葉片膜脂過氧化水平。此外，我們還發(fā)現(xiàn)缺硫脅迫引起了蒙古黃芪莖中總黃酮以及全株各部位4種主要異黃酮成分含量的顯著升高，這與我們之前研究中發(fā)現(xiàn)黃芪在面對鎘脅迫時也會大量積累異黃酮成分相一致[27]。在此前的研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)缺硫處理引起了擬南芥和水稻植株中黃酮類物質的積累，并且推斷這些黃酮類物質在抵抗缺硫引起的氧化脅迫中具有積極作用[28～29]。因此，我們推斷蒙古黃芪中黃酮類物質合成的增加可能在提高其對缺硫脅迫適應能力中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，缺硫脅迫通過減少黃芪幼苗葉綠素含量、降低光合效率以及提高細胞膜脂過氧化水平等途徑阻礙了黃芪幼苗的生長發(fā)育，引起了黃芪幼苗的缺硫脅迫反應。蒙古黃芪相比膜莢黃芪表現(xiàn)出了較強的缺硫適應能力，主要機制包括提高缺硫脅迫下葉片光保護能力以及主要異黃酮成分大量合成積累等。