姜 騁 張 曦 田 晴 李 莉

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

堿性螺旋—環(huán)—螺旋蛋白(Basic helix-loop-helix protein,bHLH)是一類含有眾多成員的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于動物、植物以及微生物中[1]。bHLH基因家族因包含有bHLH結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由60個左右的保守氨基酸序列組成，包含兩個保守但功能不同的結(jié)構(gòu)域，一個是位于N端的堿性氨基酸區(qū)，其作用是識別并特異性結(jié)合靶基因啟動子中的DNA基序，另一個是位于C端的螺旋—環(huán)—螺旋區(qū)，其主要功能是進(jìn)行域二聚，促進(jìn)蛋白—蛋白相互作用，并允許形成同型二聚體或異型二聚體來控制基因轉(zhuǎn)錄。bHLH蛋白結(jié)構(gòu)中除了高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域外，其他序列的保守性較差[2]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物bHLH基因參與了廣泛的生物學(xué)過程中，包括光信號調(diào)節(jié)[3]；激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]；響應(yīng)高鹽、干旱、機械損傷、氧化脅迫[5]、低溫脅迫[6]、缺鐵反應(yīng)[7]和類黃酮類物質(zhì)合成[8]等。目前通過大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多響應(yīng)逆境脅迫的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。例如Liu等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)bHLH122增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱、高鹽以及滲透壓的抵抗力，同時bHLH122可以直接調(diào)控參與抗逆響應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明bHLH122是一個干旱及其他逆境信號通路的轉(zhuǎn)錄激活子[9]。水稻OsbHLH148和RERJ1(OsbHLH006)基因能夠通過茉莉酸信號途徑參與干旱脅迫和損傷反應(yīng)的應(yīng)答[10～11]。小麥的TabHLH39在擬南芥中過表達(dá)后，增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽害、干旱及氧化作用的耐受性[12]。Jin等報道，秋子梨PubHLH1基因能夠增強轉(zhuǎn)基因植株對冷害的抵抗性，并且激活了逆境應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是我國東北地區(qū)具有重要應(yīng)用價值的樹種之一。本課題組前期對高鹽、干旱脅迫下白樺基因的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，獲得了逆境脅迫誘導(dǎo)下基因的表達(dá)信息,根據(jù)高鹽、干旱不同脅迫時間下基因表達(dá)量比較分析的結(jié)果，選出一個差異表達(dá)顯著的bHLH基因，命名為BpbHLH112。為了進(jìn)一步研究該基因調(diào)控白樺應(yīng)答逆境脅迫響應(yīng)的功能，本研究克隆了BpbHLH112的編碼區(qū)序列，對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對鹽和干旱脅迫下BpbHLH112的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，進(jìn)一步克隆獲得BpbHLH112基因啟動子序列。順式作用元件預(yù)測分析結(jié)果表明，該區(qū)域包含多個逆境響應(yīng)和激素響應(yīng)等順式作用元件,因而構(gòu)建了BpbHLH112啟動子片段融合GUS報告基因的表達(dá)載體,采用煙草中瞬時表達(dá)的方法對該啟動子在正常條件和脅迫條件下的GUS基因表達(dá)的特性進(jìn)行了比較分析，本研究結(jié)果為深入研究BpbHLH112基因調(diào)控白樺應(yīng)對非生物脅迫作用的分子機理提供了依據(jù)，具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

白樺無性系組培苗由本課題組保存。將組培生根苗移栽到黑土∶蛭石∶珍珠巖=5∶3∶2的基質(zhì)中培養(yǎng)8周，選取株高和長勢一致的幼苗，分別進(jìn)行200 mmol·L-1NaCl、18%(w/v)PEG6000澆灌處理，處理時間為0、6、12、24、48、72 h，每個時間點均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。分別剪取處理后植株的根組織，液氮速凍后保存于-80℃，用于總RNA的提取。

1.2 白樺BpbHLH112基因及其啟動子的克隆

參照“植物RNA提取試劑盒”(BioTeke)的操作流程，提取白樺葉片和根組織的總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TakaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在BpbHLH112基因開放閱讀框兩端設(shè)計基因上游引物(5′-ATGGCAGAGGAATTTCAGGC-3′)和下游引物(5′-CCTGAATGTTCCCCCAAATG-3′)，以白樺cDNA為模板，擴(kuò)增白樺BpbHLH112基因全長編碼序列(ORF)，使用DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物，然后克隆到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測序驗證。

根據(jù)“新型快速植物基因組DNA提取試劑盒”(BioTeke)說明書，以白樺無性系葉片為材料提取基因組DNA，根據(jù)序列比對分析結(jié)果，在BpbHLH112基因啟動子區(qū)的兩端設(shè)計上游引物bHPro-F(5′-CGAGCTCCTGATGGCGATTTTTGTGACT-3′)和下游引物bHPro-R(5′-AGATCTATGTAGCCATCCACCAGTTT-3′)，以白樺DNA為模板，擴(kuò)增BpbHLH112基因啟動子片段，PCR產(chǎn)物膠回收純化后與克隆載體pMD18-T連接，命名為pMD18-T-BpbHLH112pro，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，PCR驗證陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3 白樺BpbHLH112基因及啟動子序列的生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy的ProtParam tool(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)程序分析BpbHLH112編碼蛋白的相對分子量、等電點等理化性質(zhì)，使用在線網(wǎng)站http://smart.emblheidelberg.de進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。通過NCBI中的BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp)獲取其同源蛋白的氨基酸序列，利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對，采用MEGA5.1軟件中鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

運用在線分析工具PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)對BpbHLH112基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

使用New PLACE[13](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE[14](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測BpbHLH112基因啟動子的主要順式作用元件。

1.4 高鹽和干旱脅迫下白樺BpbHLH112基因的表達(dá)模式分析

采用軟件Primer 5設(shè)計實時熒光定量PCR上游引物(5′-CGGTCTCCGATCAGAACTCC-3′)和下游引物(5′-TTGCTCTCACCTCTCCCACT-3′)。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒使用說明。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。以白樺Tubulin基因(GenBank number：FG067376)作為內(nèi)參，其擴(kuò)增引物為5′-TCAACCGCCTTGTCTCTCTCAGG-3′和5′-TGGCTCGAATGCACTGTTGG-3′，每個樣品重復(fù)3次，用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因的相對表達(dá)量分析。

1.5 白樺BpbHLH112基因啟動子融合GUS基因表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)pCAMBIA1301載體和BpbHLH112基因啟動子序列的融合特性，結(jié)合ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)的使用說明，設(shè)計帶限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BglⅡ酶切位點的啟動子上下游引物(見表1)，其中p1301-GUS-F和p1301-GUS-R為pCAMBIA1301載體序列引物，用于驗證目的片段是否連接到載體上。

表1BpbHLH112啟動子片段與GUS基因融合所用引物序列

Table 1 A list of primers used to construct theBpbHLH112 promoter:GUS expression vector

注：‘—’為線性化載體兩末端同源序列；‘=’為用于載體線性化的酶切位點

Note:‘—’the labeled nucleotides were the homologous sequences to vector;‘=’ nucleotides underlined were used for producingXbaⅠ andBglⅡ restriction site

以攜帶有BpbHLH112啟動子片段的pMD18-T-BpbHLH112pro質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)膠回收和雙酶切驗證，同時以pCAMBIA1301空載體為對象，用XbaⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳檢測后回收較大載體片段。將啟動子片段BpbHLH112pro與去除了CaMV35S啟動子的pCAMBIA1301載體片段進(jìn)行無縫連接，使BpbHLH112啟動子片段代替pCAMBIA1301載體中的CaMV35S啟動子，并與GUS報告基因融合。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌注射滲透法瞬時轉(zhuǎn)化煙草過程參考Yang等[15]，分別將含有陽性對照、陰性對照和重組載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，把經(jīng)PCR驗證和測序比對正確的轉(zhuǎn)化子導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，經(jīng)菌液PCR驗證的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用滲透液[10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 mmol·L-1AS，pH=5.7]重懸后，注射到6周齡的煙草植株葉片中，浸染后的植株繼續(xù)培養(yǎng)2 d，用直徑為1 cm的葉片打孔器制備煙草葉盤，并進(jìn)行脅迫處理。

將浸染2 d后的葉盤分為4組，分別用H2O(對照)、200 NaCl mmol·L-1、18% PEG6000及100 mmol·L-1ABA脅迫處理24 h，然后進(jìn)行GUS染色分析和GUS酶活定量分析。

1.7 GUS活性的組織化學(xué)染色分析和定量分析

按照J(rèn)efferson[16]等的方法對轉(zhuǎn)基因煙草葉盤進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析。侵染后的葉盤洗凈后置于GUS染色液中，37℃保溫過夜，用脫色液脫色，觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

稱取100 mg脅迫處理后的葉盤加入3倍體積的GUS提取緩沖液[50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液,10 mmol·L-1EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%(w/v) SDS和0.1% β-巰基乙醇]，研磨成勻漿，離心收集上清。利用TAKARA Bradford protein assay kit測定總蛋白含量，使用Infinie200 PRO多功能酶標(biāo)儀測定樣品的熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpbHLH112基因的克隆與序列分析

利用BpbHLH112基因特異性引物，以白樺根和葉片cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得BpbHLH112基因開放閱讀框(ORF)擴(kuò)增片段(見圖1)。根據(jù)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果以及對ORF序列的生物信息學(xué)分析表明，白樺BpbHLH112基因ORF序列全長為1 431 bp，編碼1個由476個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(見圖1)。預(yù)測分子量為52.05 kD，理論等電點(Theoretical pI)為5.78。該蛋白主要由絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酰胺(Gln)等22種氨基酸構(gòu)成，其中絲氨酸(Ser)的含量最高，占14.7%。脂溶系數(shù)(Aliphatic index)為55.92，總平均親水性平均指數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.593，說明BpbHLH112蛋白是一個親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)分析顯示該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為57.80，可能是一個不穩(wěn)定蛋白。

圖2 白樺BpbHLH112與其他物種同源蛋白多序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of BpbHLH112 and bHLHs from the other plants

圖3 白樺BpbHLH112與其他物種同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹 分支上的數(shù)值表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點的可信度Fig.3 Phylogentic tree analysis of BpbHLH112 and bHLHs from the other plants The numerical value on the branch indicates the credibility of the node based on 1 000 repetitions in bootstrap verification

利用NCBI上的BLASTP工具，對BpbHLH112進(jìn)行氨基酸序列同源性的檢索，找出與其序列一致性相對較高的來自9個物種的bHLH蛋白序列。多重序列比對分析結(jié)果表明(見圖2)，白樺BpbHLH112轉(zhuǎn)錄因子與其他bHLH轉(zhuǎn)錄因子都含有一個高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)于白樺bHLH112的349～409位氨基酸殘基處，這一保守結(jié)構(gòu)域由60個氨基酸構(gòu)成，分為兩個功能不同的區(qū)域：basic區(qū)域(堿性氨基酸區(qū))含16個氨基酸，HLH區(qū)域含44個氨基酸殘基，該區(qū)域是具有螺旋環(huán)螺旋區(qū)域基因家族所特有的bHLH保守結(jié)構(gòu)域。不同植物的bHLH蛋白存在幾段長度不等的序列高度保守區(qū)域，可以推測這些序列可能是該蛋白的重要功能位點。白樺bHLH112蛋白與櫟樹(Quercusruber)、歐洲葡萄(Vitisvinifera)、銀白楊(Populusalba)的氨基酸序列一致性較高，分別為75%、64%和63%。

利用MEGA5.1將白樺BpbHLH112氨基酸序列與其他物種bHLH序列進(jìn)行聚類分析，采用最大似然法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明白樺BpbHLH112與櫟樹bHLH同源蛋白的親緣關(guān)系較近(見圖3)。

運用在線分析工具PredictNLS預(yù)測BpbHLH112蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，BpbHLH112可能定位在細(xì)胞核上，預(yù)測可信度為92。

圖4 鹽和干旱脅迫下白樺根中BpbHLH112基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of BpbHLH112 under salt and PEG6000 stress

2.2 高鹽和干旱脅迫處理下BpbHLH112基因的表達(dá)模式分析

為了研究白樺BpbHLH112基因在鹽和干旱脅迫處理下的表達(dá)模式，分別用200 mmol·L-1NaCl或18% PEG6000脅迫處理2個月大的白樺實生苗，在0、6、12、24、48、72 h分別對各處理的根組織取材，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作模板進(jìn)行實時RT-PCR，結(jié)果如圖4所示。

經(jīng)NaCl處理6～48 h的時間內(nèi)，白樺BpbHLH112基因的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，在處理48 h時達(dá)到最高，其表達(dá)量高于0 h對照(即未脅迫脅迫)的9倍以上，隨著脅迫時間的延長，在72 h時又回落到6 h的水平。在PEG6000處理6～12 h的時間內(nèi)，白樺BpbHLH112基因的相對表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化，在處理24 h后，與0 h對照相比，其表達(dá)量呈顯著上升趨勢，在處理72 h時達(dá)到最高，為對照的7倍以上。以上分析表明，白樺BpbHLH112基因能夠?qū)}或干旱脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。

2.3 BpbHLH112基因啟動子克隆和順式作用元件預(yù)測分析

以白樺DNA為模板，采用上游引物bHPro-F和下游引物bHPro-R，擴(kuò)增BpbHLH112基因啟動子片段，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其條帶大小與目的片段實際大小相一致(見圖5A)。將啟動子片段與載體pMD18-T的連接片段pMD-18-T-pBpbHLH112pro轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR驗證的陽性克隆菌液送測序。測序結(jié)果顯示，獲得的啟動子片段與白樺全基因組測序結(jié)果中該基因啟動子序列的比對完全一致。

使用New PLACE和PlantCARE在線軟件分析預(yù)測BpbHLH112啟動子所含有的順式作用元件，分析結(jié)果顯示：BpbHLH112基因啟動子區(qū)域除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件之外，還包含了一些激素相關(guān)元件，如脫落酸應(yīng)答相關(guān)元件ABRELATERD1和ABRERATCAL；赤霉素應(yīng)答元件GAREAT、MYBGAHV和WRKY71OS；生長素、水楊酸和光響應(yīng)元件ASF1MOTIFCAMV；水楊酸響應(yīng)元件WBOXATNPR1等；逆境脅迫響應(yīng)元件如干旱響應(yīng)元件MYB1AT和MYBCORE；干旱及低溫響應(yīng)相關(guān)元件MYCCONSENSUSAT；鹽及病原物響應(yīng)相關(guān)元件GT1GMSCAM4；鹽響應(yīng)、水楊酸及光響應(yīng)元件GT1CONSENSUS；損傷響應(yīng)元件WBOXNTERF3；抗病響應(yīng)相關(guān)元件BIHD1OS等，光響應(yīng)元件如GATABOX、IBOXCORE、INRNTPSADB等。除此之外，BpbHLH112基因啟動子還含有多個參與保衛(wèi)細(xì)胞中K+滲入通道基因表達(dá)的TAAAGSTKST1元件、Ca2+響應(yīng)相關(guān)順式元件ABRERATCAL、參與Ca2+/calmodulin信號響應(yīng)的“CGCG box”、光合作用中碳代謝相關(guān)元件DofCOREZM、參與轉(zhuǎn)錄激活A(yù)RR1AT元件、花粉特異表達(dá)的順式作用元件POLLEN1LELAT52等其他控制植物生長發(fā)育的順式作用元件(見表2)，這表明BpbHLH112基因啟動子的活性可能受多種因素的調(diào)節(jié)。

2.4 BpbHLH112啟動子融合GUS報告基因表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD-18-T-pBpbHLH112為模板，并以bHPro-F/bHPro-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4A所示，其條帶大小與BpbHLH112基因啟動子片段實際大小相一致，膠回收后連接去除35S啟動子的pCAMBIA1301載體的骨架片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，提取質(zhì)粒并用pCAMBIA1301載體引物p1301-GUS-F/1301-GUS-R和啟動子擴(kuò)增片段引物交叉進(jìn)行PCR驗證(見圖5B)，證明BpbHLH112基因啟動子片段已經(jīng)連接到pCAMBIA1301載體上，采用液氮凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,在含有50 mg·L-1Kana和50 mg·L-1Rif的LB培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性克隆,可用于后續(xù)的試驗。

圖5 BpbHLH112基因啟動子融合GUS載體構(gòu)建 A.BpbHLH112啟動子克隆(M. DL2000 DNA Marker；1.BpbHLH112基因啟動子全長)；B.BpbHLH112啟動子重組質(zhì)粒檢測(M. DL2000 DNA Marker; 1. BpbHLH112啟動子引物和pCAMBIA1301載體引物交叉PCR產(chǎn)物)Fig.5 Construction of GUS expression vector fused with BpbHLH112 promoter fragment A.Cloning of the promoter of BpbHLH112 gene(M. DL2000 DNA Marker; 1. Full length of BpbHLH112 promoter); B.Detection of recombinant plasmid of BpbHLH112 promoter(M. DL2000 DNA Marker; 1. PCR product using combined primers derived from vector and BpbHLH112 promoter)

2.5 BpbHLH112啟動子驅(qū)動GUS報告基因的表達(dá)分析

利用注射法將攜帶有BpbHLH112啟動子片段重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌浸染煙草葉片，陽性對照為帶有CaMV 35S啟動子的pCAMBIA1301載體質(zhì)粒，而去除CaMV 35S啟動子的pCAMBIA1301載體質(zhì)粒作為陰性對照。

GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果如圖6A所示，陰性對照未被染上藍(lán)色，而陽性對照被染成了明顯的深藍(lán)色。在實驗組中， 轉(zhuǎn)入BpbHLH112啟動子片段載體質(zhì)粒的葉盤在H2O對照處理下染色較淺，而經(jīng)過NaCl、PEG6000和ABA處理后，浸染后的葉片染色效果明顯加深，表明BpbHLH112啟動子片段能夠響應(yīng)干旱、鹽和ABA脅迫，驅(qū)動GUS基因在煙草葉片中的表達(dá)。進(jìn)一步對BpbHLH112啟動子片段的轉(zhuǎn)基因煙草葉片在脅迫處理后的GUS酶活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明(見圖6B)，在鹽、干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)入BpbHLH112啟動子片段的葉盤中GUS酶活性均有顯著的變化，分別是H2O對照處理葉盤中GUS酶活性的9.82、12.14和8.09倍。由此可進(jìn)一步表明，BpbHLH112啟動子受干旱、鹽及ABA脅迫誘導(dǎo)，屬于逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動子。

表2 白樺BpBHLH112啟動子的部分順式作用元件

注：堿基序列:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

Note:Base sequence:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

圖6 BpbHLH112啟動子片段對非生物脅迫響應(yīng)分析 A.NaCl、PEG6000和ABA脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉盤GUS組織化學(xué)染色分析；B. NaCl、PEG6000和ABA脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草GUS酶活分析，所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)Fig.6 Analysis of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under salt,drought and ABA treatments A. GUS histochemical staining of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under NaCl,PEG6000 and ABA treatments; B. GUS activity of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under NaCl,PEG6000 and ABA treatments Values represent the means±SD from three repeats

3 討論

植物在生長發(fā)育的過程中會受到各種不利環(huán)境的影響,為了在變化多端的環(huán)境中更好地生存,植物會在環(huán)境發(fā)生變化時調(diào)控特定抗逆基因的表達(dá)[17]。逆境相關(guān)基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是通過啟動子中逆境誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件與反式作用因子的相互作用來實現(xiàn)的[18～19]。本研究基于鹽、干旱脅迫下白樺轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析結(jié)果，選出白樺BpbHLH112基因，對其表達(dá)模式分析表明，BpbHLH112基因能夠響應(yīng)鹽和干旱脅迫反應(yīng)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BpbHLH112啟動子能夠被鹽、干旱及ABA脅迫因子激活，驅(qū)動下游基因的表達(dá)，屬于多逆境誘導(dǎo)型啟動子。

BpbHLH112啟動子活性受干旱誘導(dǎo)，這可能與啟動子中含有3個干旱應(yīng)答相關(guān)順式元件有關(guān)。在BpbHLH112啟動子中存在有1個MYB1AT基序、6個MYCCONSENSUSAT基序和2個MYBCORE基序。Abe等人分別于1997[20]和2003年[21]證明，擬南芥的干旱響應(yīng)基因RD22啟動子中MYB1AT和MYCCONSENSUSAT元件可以與MYB或bHLH轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，在干旱和ABA脅迫下顯著增強靶基因的表達(dá)。Urao等發(fā)現(xiàn)，擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合MYBCORE元件，調(diào)節(jié)脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)[22]，我們推測BpbHLH112啟動子中的干旱應(yīng)答相關(guān)順式元件對啟動子在干旱處理下活性的升高起重要作用。

BpbHLH112啟動子活性也受NaCl一定程度的誘導(dǎo)。前人研究發(fā)現(xiàn)，許多植物基因的啟動子中含有序列保守的GT元件[23]，擬南芥調(diào)控因子TFIIA-TBP-TATA可以與GT-1元件結(jié)合形成復(fù)雜的復(fù)合體，調(diào)控植物基因的轉(zhuǎn)錄過程[24～25]。Park等報道了GT-1-like轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合GT-1 box(GT1GMSCAM4)元件，在大豆SCaM-4基因啟動子響應(yīng)病原菌和NaCl誘導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控中起正調(diào)控作用[26]。從序列分析結(jié)果可知，BpbHLH112啟動子中存在有5個GT1GMSCAM4元件，它們可能對BpbHLH112啟動子在高鹽脅迫下的表達(dá)活性提高起到調(diào)控作用。這與早前對豌豆PsSEOF1基因[27]和甜瓜CmLOX08[28]基因啟動子功能研究的結(jié)果相一致。

ABA是重要的植物激素之一，不僅參與多個植物生長發(fā)育過程，而且作為脅迫激素參與植物對外界脅迫條件的適應(yīng)[29]。植物轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)干旱、高鹽、低溫等脅迫信號應(yīng)答的途徑有兩種：一種是依賴于ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，另一種是不依賴于ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[30]。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合ABA脅迫相關(guān)的順式作用元件如ABREs、DRE/CRTs或者含有MYB和MYC蛋白結(jié)合位點(MYBR和MYCR)等激活植物對逆境的應(yīng)激反應(yīng)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在BpbHLH112啟動子區(qū)域分布有1個ABRELATERD1元件、1個ACGTATERD1和3個ABRERATCAL元件。Nakashima等報道，擬南芥脫水誘導(dǎo)基因RD29B和RD29A啟動子中ABA響應(yīng)元件ABREs與亮氨酸拉鏈類(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子AREBs結(jié)合，激活靶基因在特定環(huán)境條件下表達(dá)[32]。因此，BpbHLH112啟動子中的ABREs元件對該啟動子在ABA處理下的活性升高可能是一種正調(diào)控作用，但是BpbHLH112基因是通過依賴或不依賴ABA信號途徑對高鹽和干旱脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)尚需進(jìn)一步的研究。

鈣離子(Ca2+)作為第二信使參與各種細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以鈣離子及其靶蛋白鈣調(diào)素為核心的鈣信使系統(tǒng)在植物應(yīng)對逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著中心作用[33～34]。Yang報道，6個擬南芥信號應(yīng)答基因AtSR1-6能夠被多種環(huán)境脅迫如高溫、高鹽、UV、損傷以及多種信號分子如茉莉酸甲脂、H2O2和SA處理誘導(dǎo)表達(dá)，AtSR1-6基因編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，它們與CGCGBOX基序結(jié)合促進(jìn)抗逆基因的激活與表達(dá)[35]。在BpbHLH112啟動子區(qū)域存在有4個CGCG box元件，對其可能結(jié)合的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的鑒定及其功能可以進(jìn)一步深入研究。此外，BpbHLH112啟動子還包含有3個TAAAG元件，該種元件參與了馬鈴薯保衛(wèi)細(xì)胞中K+滲入通道基因KST1的表達(dá)[36]，因此，對BpbHLH112啟動子TAAAG元件功能的進(jìn)一步研究可能了解TAAAG元件結(jié)合的調(diào)控因子以及控制保護(hù)細(xì)胞特異性基因表達(dá)的機制。

本研究初步分析了BpbHLH112基因及其啟動子響應(yīng)高鹽、干旱和外源ABA脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了一些與非生物脅迫以及逆境信號傳導(dǎo)相關(guān)的元件，為后續(xù)研究該基因啟動子轉(zhuǎn)錄應(yīng)答反應(yīng)機制提供了理論基礎(chǔ)，后續(xù)研究可構(gòu)建啟動子5′缺失突變體和主要調(diào)節(jié)區(qū)域定點突變，從而找到核心啟動子區(qū)域和功能作用元件，進(jìn)一步應(yīng)用于林木遺傳育種改良研究。